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苏云金芽孢杆菌FZ62蛋白酶分离纯化及性质研究

作　者: 韩科
导　师: 郑毅
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 苏云金芽孢杆菌 蛋白酶 分离纯化 酶促动力学 功能基团修饰
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


苏云金芽孢杆菌FZ62蛋白酶发酵液,分别经过硫酸铵沉淀、Sephadex G-25分子筛脱盐、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析、Sephadex G-75分子筛柱层析对蛋白酶进行纯化,获得SDS-PAGE电泳单一条带的蛋白酶。该纯化过程中,酶的总回收率为9.28%,其比活力为3159.44 U/mg。将蛋白印迹到PVDF膜上后进行N-端测序,前10个残基为:1-GGNNKVGSGK-10。测量蛋白酶的理化性质,其分子量为38.92 kDa,催化酪蛋白水解的最适pH为7.2,在pH 7-12区域内较稳定,pH＞13时酶迅速失活,酶促最适温度为55℃,50℃以下酶的热稳定性好。以酪蛋白为底物,酶促反应符合米氏方程,Km=0.71 g/L,Vm=2000.00μg/mL/min,活化能为50.22kJ/mol,55℃时的活化焓变为47.49 kJ/mol、活化自由能为84.48 kJ/mol、活化熵变为-0.113 kJ/mol/k。研究金属离子对蛋白酶活力的影响。结果表明,Na+、K+、Li+和Mg2+等金属离子对酶活力没有任何影响。Ca2+对酶活力有微弱抑制作用,Zn2+、Cu2+、Hg2+和Al3+对该酶有不同程度的抑制作用。研究Zn2+、Cu2+、Hg2+和Al3+的抑制动力学,结果表明:这些金属离子对蛋白酶表现为可逆抑制作用,Zn2+的抑制类型为反竞争型,抑制常数KI为1.35g/L。Cu2+为混合型类型,抑制常数KI为1.39g/L。Hg2+为混合型,抑制常数KI为1.2g/L。Al3+为竞争性抑制,抑制常数KI为0.6 g/L。金属螯合剂（EDTA）处理蛋白酶,浓度为1.2 mmol/L时酶活力完全丧失,说明该酶是金属蛋白酶。探究Fe3+对酶活力的影响,结果显示:加入Fe3+后酶活力最可增大2.5倍,在经EDTA处理后的蛋白酶液中,加入Fe3+其终浓度为2mmol/L时,酶活力可恢复59.77%,初步判定Fe3+是该金属蛋白酶的活性中心辅基。研究几种有机溶剂对蛋白酶活力的影响。结果表明:甲醇、乙醇、正戊醇三种伯醇对酶均有抑作用,抑制强度相近。甲醇对酶的抑制作用略比其他两种伯醇弱。异丙醇对酶效应为可逆抑制作用,IC50为14%,其抑制机理表现为竞争型抑制,KI为0.243 g/L。甲醛对酶的活性有很强抑制作用,其IC50为88 mmol/L,是一种可逆反竞争型抑制作用,抑制常数KI为0.036 g/L。选择氯胺-T、顺丁烯二酸酐、DTT、β-巯基乙醇、N-溴代丁二酰亚胺（NBS）、溴乙酸（BrAc）、乙酰丙酮、苯甲基磺酸氟（PMSF）、N-乙酰咪唑为修饰剂,对蛋白酶进行修饰。结果表明:NBS、BrAc、PMSF对酶有相当的抑制作用。NBS修饰蛋白酶分子中的色氨酸残基,结合荧光发射光谱和紫外吸收光谱的变化分析,经NBS修饰后,酶活力丧失的同时,441 nm处的荧光发射峰峰高下降及277 nm处的紫外吸收峰消失,说明色氨酸是该蛋白酶的活性中心基团。BrAc、PMSF修饰酶后,酶活力也受到影响,从结果显示,组氨酸、丝氨酸是维持酶活性特定结构的重要基团。

全文目录


摘要  2-4
Abstract  4-6
中文文摘  6-12
绪论  12-36
  1.1 蛋白酶的研究进展  12-17
    1.1.1 蛋白酶及其分类  12
    1.1.2 微生物蛋白酶来源的优越性  12-14
    1.1.3 蛋白酶的来源  14-16
    1.1.4 蛋白酶的应用  16-17
    1.1.5 耐热蛋白酶  17
  1.2 苏云金芽孢杆菌概述  17-19
    1.2.1 苏云金芽孢杆菌  17-19
    1.2.2 苏云金芽孢杆菌产生的蛋白酶  19
  1.3 蛋白酶的纯化、鉴定和测序  19-23
    1.3.1 蛋白酶的纯化  19-21
    1.3.2 蛋白酶的鉴定及序列测定  21-23
  1.4 蛋白酶的酶学特性  23-32
    1.4.1 理化性质  23
    1.4.2 酶促反应动力学  23-29
    1.4.3 酶的抑制作用  29-31
    1.4.4 EDTA对酶的修饰  31-32
  1.5 蛋白酶的活性部位及修饰  32-34
    1.5.1 蛋白酶的活性部位  32
    1.5.2 蛋白酶的化学修饰  32-34
  1.6 试验研究的内容  34
  1.7 试验研究的意义  34-36
第1章 Bacillus thuringiensis FZ62蛋白酶的分离纯化及N端序列分析  36-50
  1.1 前言  36
  1.2 材料  36-39
    1.2.1 酶液  36
    1.2.2 培养基  36
    1.2.3 试剂  36
    1.2.4 缓冲液及其他溶液配置  36-38
    1.2.5 仪器  38-39
  1.3 方法  39-45
    1.3.1 酶活力和比活力测定  39-40
    1.3.2 蛋白质浓度的测定  40-41
    1.3.3 纯化试剂预处理  41
    1.3.4 酶的分离纯化  41-43
    1.3.5 蛋白酶的纯度鉴定  43
    1.3.6 蛋白酶的免疫印迹  43-44
    1.3.7 蛋白酶测序  44-45
  1.4 结果与分析  45-50
    1.4.1 硫酸铵分级沉淀  45
    1.4.2 脱盐  45-46
    1.4.3 离子交换层析  46-47
    1.4.4 分子筛层析  47-48
    1.4.5 蛋白酶分离纯化各步骤结果汇总  48
    1.4.6 酶的纯度鉴定及蛋白印迹  48
    1.4.7 蛋白酶的测序  48-49
    1.4.8 小结与讨论  49-50
第2章 Bacillus thuringiensis FZ62蛋白酶的理化性质及催化动力学特征  50-62
  2.1 前言  50
  2.2 材料  50
    2.2.1 试剂  50
    2.2.2 仪器  50
  2.3 方法  50-52
    2.3.1 酶活力测定  50
    2.3.2 酶的分子量的测定  50-51
    2.3.3 酶分子的紫外吸收光谱测定  51
    2.3.4 酶分子的内源荧光光谱测定  51
    2.3.5 温度对酶活力的影响  51
    2.3.6 酶的热稳定性  51
    2.3.7 pH对酶活力的影响  51
    2.3.8 酶的酸碱稳定性  51
    2.3.9 酶催化反应的动力学性质研究  51-52
  2.4 结果与分析  52-60
    2.4.1 酶的分子量测定  52-53
    2.4.2 酶分子的紫外吸收光谱测定  53-54
    2.4.3 酶分子的内源荧光光谱测定  54
    2.4.4 温度对酶活力的影响  54-55
    2.4.5 酶的热稳定性  55
    2.4.6 pH对酶活力的影响  55
    2.4.7 酶的酸碱稳定性  55-56
    2.4.8 酶催化反应的动力学性质研究  56-57
    2.4.9 酶催化底物Casein水解反应的活化能测定  57-60
  2.5 小结与讨论  60-62
第3章 金属离子对Bacillus thuringiensis FZ62蛋白酶活力的影响  62-80
  3.1 前言  62
  3.2 材料  62
    3.2.1 试剂  62
    3.2.2 仪器  62
  3.3 方法  62-63
    3.3.1 酶活力测定  62
    3.3.2 正一价碱金属离子对酶的效应  62
    3.3.3 二价金属离子对蛋白酶活力的影响  62-63
    3.3.4 正三价金属离子对蛋白酶的影响  63
    3.3.5 重金属离子对酶活力的影响  63
    3.3.6 金属离子对蛋白酶抑制效应及抑制常数的测定  63
    3.3.7 EDTA对酶活力的影响  63
    3.3.8 金属离子对蛋白酶分子后紫外和荧光光谱的变化  63
  3.4 结果与分析  63-77
    3.4.1 正一价碱金属离子对酶活力的效应  63-64
    3.4.2 二价金属离子对酶活力的影响  64
    3.4.3 ZnSO_4对蛋白酶的影响  64-66
    3.4.4 CuSO_4对蛋白酶的影响  66-68
    3.4.5 重金属HgCl_2对蛋白酶酶的影响  68-72
    3.4.6 三价金属Al_2(SO_4)_3对蛋白酶的影响  72-75
    3.4.7 金属离子对蛋白酶影响的各参数  75
    3.4.8 酶的活性中心研究  75-77
  3.5 讨论  77-80
第4章 有机溶剂对Bacillus thuringiensis FZ62蛋白酶活力的影响  80-88
  4.1 前言  80
  4.2 材料  80
    4.2.1 试剂  80
    4.2.2 仪器  80
  4.3 方法  80-81
    4.3.1 酶活力测定  80
    4.3.2 有机溶剂对蛋白酶活力的影响  80-81
  4.4 结果与分析  81-85
    4.4.1 几种伯醇对酶活力的影响  81
    4.4.2 异丙醇对酶的影响  81-83
    4.4.3 甲醛对蛋白酶的影响  83-85
    4.4.4 有机溶剂对蛋白酶影响参数  85
  4.5 讨论  85-88
第5章 Bacillus thuringiensis FZ62蛋白酶侧链功能基团的修饰  88-98
  5.1 前言  88
  5.2 材料  88
    5.2.1 试剂  88
    5.2.2 仪器  88
  5.3 方法  88-90
    5.3.1 酶活力测定  88
    5.3.2 蛋氨酸硫醚基的修饰  88-89
    5.3.3 赖氨酸ε-氨基的化学修饰  89
    5.3.4 二硫键的化学修饰  89
    5.3.5 半胱氨酸巯基的化学修饰  89
    5.3.6 色氨酸吲哚基的化学修饰  89
    5.3.7 组氨酸咪唑基的化学修饰  89
    5.3.8 精氨酸胍基的化学修饰  89-90
    5.3.9 丝氨酸羰基的化学修饰  90
    5.3.10 酪氨酸羟基的化学修饰  90
  5.4 结果与分析  90-97
    5.4.1 蛋氨酸硫醚基的修饰  90
    5.4.2 赖氨酸ε-氨基的化学修饰  90-91
    5.4.3 二硫键的化学修饰  91-92
    5.4.4 半胱氨酸巯基的化学修饰  92-93
    5.4.5 色氨酸吲哚基的化学修饰  93-95
    5.4.6 组氨酸咪唑基的化学修饰  95
    5.4.7 精氨酸胍基的化学修饰  95-96
    5.4.8 丝氨酸羰基的化学修饰  96-97
    5.4.9 酪氨酸羟基的化学修饰  97
  5.5 讨论  97-98
结论与展望  98-100
  结论  98-99
    1.蛋白酶的分离纯化  98
    2.蛋白酶的N端鉴定  98
    3.蛋白酶的性质及催化动力学特征  98
    4.金属离子对蛋白酶活力的影响  98-99
    5.有机溶剂对蛋白酶活力的影响  99
    6.蛋白酶侧链功能基团的修饰  99
    7.光谱变化研究酶活力与构象的影响  99
  展望  99-100
参考文献  100-109
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  109-110
致谢  110-112
作者简介  112-113

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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