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BK_（Ca）通道的功能活动可调控细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平

作　者: 李勃兴
导　师: 高天明
学　校: 第一军医大学
专　业: 神经生物学
关键词: 大电导钙激活钾通道 蛋白酩氨酸磷酸化 v-Src HEK293细胞 海马 神经元
分类号: Q26
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


大电导钙激活钾通道(BKCa通道)作为一种由细胞去极化和细胞内钙离子浓度升高而激活的钾通道，广泛分布于神经细胞、肌细胞、腺细胞、淋巴细胞、成骨细胞等多种细胞类型。它不仅在调节动作电位的复极和发放频率、细胞膜兴奋性、平滑肌细胞收缩性、神经递质释放、学习记忆过程等中起重要作用，而且还参与了免疫调节和细胞凋亡过程，但目前对于BKCa通道下游的信号转导通路仍不了解。蛋白酪氨酸磷酸化是细胞重要的信号转导过程，它在细胞增殖、分化及凋亡等过程中都起到了重要的作用。细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平由蛋白酪氨酸激酶（PTKs）和蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPases）二者共同调控。PTKs活性增加则细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平增加；PTPases活性增加则细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平降低。当生长因子、细胞因子、神经递质等与细胞上相应受体结合后，PTKs的活性将显著增加，导致细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平升高。同时也有研究表明，细胞膜去极化和钙离子内流同样能够影响细胞内PTKs的活性及蛋白酪氨酸磷酸化水平。本实验探讨了异源表达的BKCa通道及通道激动剂、阻断剂对细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平的调节，试图寻找BKCa通道下游可能的信号转导通路。1．BKCa通道的表达降低过钒酸盐处理后细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平HEK293细胞不表达内源性BKCa通道，因此可作为研究BKCa通道异源表达的良好模型。生理状态下，HEK293细胞内PTPases的活性高于PTKs，因此细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平相对较低。PTPases特异性抑制剂过钒酸盐能够时间依赖性地增加细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平。为检测BKCa通道对细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响，我们比较了转染BKCa通道α亚基或对照质粒后HEK293细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平。用过钒酸盐处理转染了BKCa通道或对照质粒的细胞后发现，NKCa通道的表达能够显著降低细胞的酪氨酸磷酸化水平（p＜0.05，独立样本t检验），同时，β-actin对照结果显示，BKCa通道的表达并不影响细胞总蛋白量。2．BKCa通道的表达降低过表达v-Src细胞的蛋白酪氨酸磷酸化水平为检测BKCa通道能否降低PTKs激活造成的蛋白酪氨酸磷酸化水平升高，我们比较了共转染BKCa通道和非受体型酪氨酸激酶v-Src或其无活性突变体R385A Src后细胞酪氨酸磷酸化水平的变化。v-Src是细胞内重要的非受体型酪氨酸激酶，转染细胞后可以显著提高细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平。但共转染BKCa通道则使过表达v-Src细胞的蛋白酪氨酸磷酸化水平降低（p＜0.05，独立样本t检验），而共转染对照质粒则无此作用。无活性突变体R385A Src不影响细胞酪氨酸磷酸化水平，但共转染BKCa通道仍能使表达R385A Src细胞的蛋白酪氨酸磷酸化水平降低（p＜0.05，独立样本t检验）。3．BKCa通道特异性激动剂及阻断剂对细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响为确定BKCa通道的功能活动能否影响细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平，我们使用BKCa通道特异性激动剂NS1619及特异性阻断剂paxilline，观察二者对细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响。HEK293细胞本身不表达BKCa通道，单独使用NS1619或paxilline对细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平无影响（p＞0.05）。转染BKCa通道后，NS1619能进一步降低细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平（p＜0.05，One-way ANOVA），而paxilline则部分逆转BKCa通道的作用（p＜0.05，One-way ANOVA）。海马神经元表达内源性BKCa通道，NS1619降低海马神经元蛋白酪氨酸磷酸化水平，paxilline则使蛋白酪氨酸磷酸化水平升高（p＜0.05，One-way ANOVA）。综合以上结果，BKCa通道的功能活动可以调控细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平。

全文目录


摘要  3-6
ABSTRACT  6-10
前言  10-14
材料与方法  14-18
结果  18-26
讨论  26-28
小结  28-29
参考文献  29-35
论文发表情况  35-36
综述  36-49
致谢  49-51

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中图分类: > 生物科学 > 细胞生物学 > 细胞生物化学
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