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不同分化状态的间充质干细胞向肝细胞生长因子的趋化性迁移研究

作　者: 郑彦文
导　师: 张焕相
学　校: 苏州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 骨髓间充质干细胞细胞分化肝细胞生长因子细胞迁移 Rac1
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

神经胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,具有扩散和浸润的特性,即使经过外科手术切除,并辅以放疗或化疗,也难以彻底治愈。因此,需要新的治疗方法来追踪逃离常规治疗的散在瘤细胞。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是具有多向分化潜能的成体干细胞,而且能够趋向胶质瘤及多种趋化因子迁移,从而成为治疗胶质瘤的理想载体细胞。然而MSCs定向迁移的机制还不是完全清楚,尤其是MSCs分化状态与迁移之间关系的研究还未见报道。本实验旨在研究不同分化状态的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)的趋化性迁移。本研究首先采用Percoll密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离出BMSCs,体外扩增培养,通过观察细胞形态、生长特性,免疫荧光染色,成骨、成脂诱导分化,对BMSCs进行鉴定。结果显示,分离培养的BMSCs为长梭形,增殖速度快,表面抗原CD29、CD90、CD106呈阳性,CD34、CD45为阴性,并且体外能够诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞,证明分离培养的细胞是具有多向分化潜能的BMSCs。随后通过丁羟基茴香醚(butyl hydroxy anisol, BHA)联合碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)诱导BMSCs成神经分化,即先用10 ng/ml bFGF预诱导24 h,再用200μM BHA和2% DMSO诱导5 h,最后用含有N2的H-DMEM维持培养。观察该过程中细胞的形态变化,免疫细胞化学染色检测神经细胞特异性标志物nestin、β-III-tubulin及NSE的表达变化。结果显示,未分化BMSCs呈成纤维细胞样;预诱导24 h后,胞体稍有收缩,边缘变得不齐整;诱导5 h,胞体收缩成圆形或椭圆形,折光性强,有突起伸出;维持培养18 h后,细胞出现3个或更多突起;维持培养48 h,细胞突起更为复杂,出现二级分叉,突起长度增加,与其他细胞的突起相互接触。免疫荧光染色显示,nestin与β-III-tubulin的表达都呈现出先增高后降低的趋势,均在诱导5 h时达到最高值,之后显著下降;而NSE阳性细胞比率在诱导期以及维持前期都很低,到维持48 h显著升高;GFAP在整个诱导分化过程中始终为阴性。接着运用Dunn chamber装置研究了BMSCs及成神经分化不同状态BMSCs向HGF的趋化性迁移,计算细胞迁移速率和迁移效率。结果显示,在趋化性迁移实验中,即外槽加入不同浓度HGF、内槽只加L-DMEM时,细胞的迁移速率没有变化,迁移效率随着HGF浓度的增加而增高;与对照组(内外槽均只加入L-DMEM)相比,50 ng/ml及100 ng/ml HGF均显著提高了细胞的迁移效率,但两者之间没有差异。当内外槽均加入50 ng/ml HGF,细胞的迁移速率及迁移效率与对照相比无差异,表明HGF能够诱导BMSCs定向迁移。接着我们研究了成神经分化的BMSCs向HGF的趋化性迁移,结果显示外槽加入50 ng/ml HGF未能改变分化各点细胞的迁移速率,但显著提高了未分化、预诱导24 h、诱导5 h及维持48 h细胞的迁移效率,表明成神经分化的BMSCs向HGF的趋化迁移能力与其分化状态密切相关。用PI3K抑制剂LY294002(30μM)预处理1 h的BMSCs进行趋化迁移实验,外槽加入HGF后,细胞迁移效率与未处理组细胞相比显著降低,即LY294002阻断了HGF诱导BMSCs的定向迁移,证明PI3K信号通路参与介导HGF诱导BMSCs的定向迁移过程。最后,通过改变Rac1的表达水平,观察BMSCs随机迁移行为及HGF诱导的定向迁移行为的变化。发现Rac1过表达后,BMSCs迁移速率及趋向HGF的迁移效率显著提高;干扰Rac1表达后,迁移速率及趋向HGF的迁移效率显著降低。结果表明Rac1调节BMSCs的迁移速率,并且参与介导HGF诱导BMSCs的定向迁移过程。以上结果表明,HGF能够趋化BMSCs的定向迁移,PI3K信号通路参与介导这一过程;成神经分化的BMSCs趋向HGF的迁移能力与其分化状态密切相关。Rac1调节BMSCs迁移速率,并且介导HGF诱导BMSCs的定向迁移。本研究为进一步揭示BMSCs的定向迁移机制及临床应用BMSCs进行移植提供了理论基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
序言  10-17
第一部分骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定  17-31
  材料与方法  17-22
  结果  22-25
  讨论  25-27
  参考文献  27-31
第二部分骨髓间充质干细胞向神经样细胞诱导分化  31-43
  材料与方法  31-34
  结果  34-36
  讨论  36-38
  参考文献  38-43
第三部分不同分化状态BMSCs 趋向HGF 迁移的研究  43-62
  材料与方法  44-47
  结果  47-52
  讨论  52-55
  参考文献  55-62
第四部分 Rac1 表达水平对BMSCs 迁移的影响  62-75
  材料与方法  62-67
  结果  67-70
  讨论  70-72
  参考文献  72-75
结论  75-76
综述  76-90
攻读学位期间发表的论文和所获的奖励  90-91
缩略词表(Abbreviation)  91-93
本研究所获基金资助  93-94
致谢  94-95

不同分化状态的间充质干细胞向肝细胞生长因子的趋化性迁移研究

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