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融合蛋白CTP-SOD在毕赤酵母中的表达、纯化及抗氧化能力

作　者: 李沛志
导　师: 刘堰
学　校: 西南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 超氧化物歧化酶 细胞质转导肽 毕赤酵母 分泌表达 氧化胁迫
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 33次
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内容摘要


超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase SOD)是一种在生物界广泛存在的抗氧化酶,在抗衰老、抗肿瘤、抗免疫疾病和电磁辐射上都起着重要的作用。SOD主要在细胞质中发挥作用,但是由于SOD是生物大分子,没有特异性的受体和通道,不容易跨过细胞膜进入细胞质,大大降低了生物利用度。细胞质转导肽(Cytoplasmic transduction peptide CTP);是在转导肽TAT基础上人工设计的一种新型转导肽,能够携带外源大分子穿过细胞膜,定位于细胞质。本实验利用含有细胞质转导肽基因序列的SOD特异引物,以人总RNA反转录产物为模板,扩增出了CTP和铜锌超氧化物歧化酶(Cu／Zn SOD)的融合基因。将其克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K中,成功地构建重组表达载体CTP-SOD／pPIC9K。通过电激法将重组载体转化巴斯德毕赤酵母GS115,经酵母菌落PCR和SDS-PAGE筛选得到可表达重组蛋白的阳性重组子。大量诱导融合蛋白CTP-SOD表达,收集发酵上清经盐析、透析后,采用镍亲和层析介质纯化重组蛋白,蛋白纯度达到90%以上,比活为676.5U／mg。经Western-Blotting分析,进一步验证了重组蛋白的正确表达。为了分析CTP-SOD的生物功能,我们利用邻苯三酚(pyrogallol)诱导HeLa氧化损伤,研究了重组蛋白对氧化胁迫下HeLa细胞的保护作用。60μmol／L的邻苯三酚处理细胞48h后只有42.2%细胞存活下来；而CTP-SOD预处理HeLa细胞,明显提高了HeLa细胞在氧化胁迫下的存活率,随着CTP-SOD剂量的从1μmol／L增加到4μmol／L,HeLa细胞的存活率比对照组上升了10%到30%。CTP-SOD预处理HeLa细胞,明显提高了HeLa细胞的抗氧化能力,和对照组野生型SOD相比具有显著性差异。结果表明,CTP-SOD融合蛋白比野生型SOD更容易进入细胞,具有更高效的抗氧化功能。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-9
第1章 文献综述  9-19
  1.1 氧自由基和超氧化物歧化酶  9-11
    1.1.1 氧自由基的产生和危害  9-10
    1.1.2 超氧化物歧化酶  10-11
  1.2 蛋白转导肽研究进展  11-16
    1.2.1 蛋白转导域  11-12
    1.2.2 TAT转运机制研究进展  12-15
    1.2.3 应用及前景  15-16
  1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统  16-19
第2章 绪论  19-21
  2.1 研究目的与意义  19
  2.2 研究内容  19-21
第3章 实验材料及仪器  21-23
  3.1 实验材料  21-22
    3.1.1 菌株和质粒  21
    3.1.2 主要试剂  21
    3.1.3 引物及测序  21
    3.1.4 主要试剂  21-22
    3.1.5 其他  22
  3.2 主要仪器  22-23
第4章 实验方法  23-39
  4.1 取材及样品处理  23
  4.2 总RNA提取及反转录  23-24
    4.2.1 总RNA提取  23
    4.2.2 RNA完整性鉴定  23-24
    4.2.3 浓度测定  24
  4.3 RT-PCR扩增CTP-SOD基因  24-25
    4.3.1 引物设计  24
    4.3.2 cDNA第一条链的合成  24-25
    4.3.3 CTP-SOD基因扩增  25
  4.4 重组质粒CTP-SOD/pPIC9K的构建  25-26
    4.4.1 小量制备pPIC9K质粒  25-26
    4.4.2 质粒和基因的酶切与连接  26
  4.5 CTP-SOD/pPIC9K大肠杆菌克隆菌株的构建  26-28
    4.5.1 感受态E.coli Top10细胞的制备  26-27
    4.5.2 重组质粒转化E.coli Top10  27
    4.5.3 菌落PCR鉴定阳性克隆  27-28
    4.5.4 DNA测序鉴定重组质粒  28
  4.6 CTP-SOD毕赤赤酵母表达菌株的构建  28-31
    4.6.1 大量制备CTP-SOD/pPIC9K质粒  28-29
    4.6.2 CTP-SOD/pPIC9K质粒线性化  29
    4.6.3 毕赤酵母GS115感受态细胞制备  29-30
    4.6.4 电击法转化酵母细胞  30
    4.6.5 菌落PCR鉴定阳性重组子  30
    4.6.6 小量表达筛选可表达克隆  30-31
    4.6.7 诱导时间与表达量关系的确定  31
  4.7 Western blotting分析  31-33
    4.7.1 试剂配制  31-32
    4.7.2 转膜  32
    4.7.3 膜的封闭和抗体孵育  32-33
    4.7.4 增强化学发光法(ECL)显色  33
  4.8 重组蛋白的制备  33-35
    4.8.1 三角瓶大量发酵  33
    4.8.2 蛋白盐析  33
    4.8.3 透析除盐及纯化  33-34
    4.8.4 比活测定  34-35
  4.9 重组蛋白的抗氧化能力  35-39
    4.9.1 试剂的配制  36
    4.9.2 HeLa细胞培养  36-37
    4.9.3 HeLa细胞氧化损伤模型建立  37-38
    4.9.4 CTP-SOD对氧化胁迫下细胞的保护作用  38-39
第5章 实验结果与讨论  39-48
  5.1 人总RNA提取  39
  5.2 CTP-SOD基因扩增  39
  5.3 CTP-SOD基因和pPIC9K质粒的双酶切  39-40
  5.4 CTP-SOD/pPIC9K重组质粒构建  40-42
  5.5 CTP-SOD酵母工程菌的构建  42-43
    5.5.1 菌落PCR鉴定P.pastoris阳性重组子  42
    5.5.2 SDS-PAGE筛选可表达重组P.pastoris菌株  42-43
    5.5.3 诱导时间和表达量关系的确定  43
  5.6 蛋白盐析条件  43-44
  5.7 蛋白纯化及Western blotting鉴定  44-45
  5.8 CTP-SOD对氧化胁迫下细胞的保护作用  45-46
  5.9 讨论  46-48
参考文献  48-54
致谢  54-55
在学期间发表论文  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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