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pcDNA3.1（-）shVEGF/yCDglyTK治疗体系抗结肠癌的实验研究

作　者: 李玉姬
导　师: 张桂英
学　校: 中南大学
专　业: 消化内科
关键词: 结肠癌 非病毒载体 自杀基因 RNA干扰 靶向治疗
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


背景与目的：结肠癌是常见多发的恶性肿瘤之一,在全球男性、女性常见的恶性肿瘤中分别排第四位和第三位。在我国,结肠癌的发病率居全部恶性肿瘤的第四位。目前结肠癌的治疗以手术治疗为主,辅以化疗、放疗等。由于发病隐匿,大部分患者就诊时已属中晚期,失去手术机会,而化疗、放疗有严重的全身毒副作用,特异性差。因此,基因靶向治疗结肠癌是目前研究的热点。基因治疗的载体包括病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体有免疫原性,可诱发机体产生免疫反应,在安全性方面存在潜在的危险。而非病毒载体无毒性,安全性高,故在研究中应用更多。磷酸钙纳米颗粒(CPNP)作为一种非病毒载体,具有转染效率高、对人体无毒副作用、使用安全性高等特点。自杀基因如CD/5-FC、HSV-TK/GCV系统对结肠癌有杀伤作用,且CD、TK两者联合之后的协同作用较之单独作用能更好地发挥对肿瘤的杀伤作用。肿瘤血管生成对肿瘤的生长、转移起到至关重要的作用,VEGF是促进肿瘤血管生成的重要因子,使用RNA干扰技术高度特异性地沉默VEGF表达,可有效抑制肿瘤血管生成,从而达到抑制肿瘤生长的目的。因此,本实验使用非病毒载体CPNP作为基因转染载体,应用CMV增强子、CEA启动子与融合自杀基因yCDglyTK整合,联合应用针对VEGF的RNA干扰技术,研究其对人结肠癌Lovo细胞的体外靶向性杀伤作用。方法：将结肠癌Lovo细胞分五组,空白对照组(L1组),其它四组分别为用CPNP为载体瞬时转染pcDNA3.1(-) Null (L2组)、pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK (L3组)、pGenesil-shVEGF(L4组)、pcDNA3.1(-) shVEGF/yCDglyTK (L5组)等,用RT-PCR、免疫荧光检测yCDglyTK、VEGF基因的表达,用MTT法和流式细胞仪检测5-FC对各组细胞的杀伤作用和凋亡效率。实验数据采用SPSS 13.0和Excel2003进行统计分析,P＜0.05认为有统计学意义。结果：1、yCDglyTK及VEGF基因表达：(1)L3组、L5组有yCDglyTK基因mRNA及蛋白表达的增强；(2)各组细胞均有VEGF基因mRNA及蛋白的表达,其中L4组、L5组的表达较其它三组减弱。以上说明CPNP能成功介导四种质粒转染Lovo细胞。2、转染CPNP-DNA对各组Lovo细胞的增殖抑制作用：MTT结果显示L5组在5-FC的作用下生存率低于其他各组(P<O.05),说明转染联合基因治疗体系pcDNA3.1(-)shVEGF/yCDglyTK对Lovo细胞的增殖抑制作用较单独转染自杀基因yCDglyTK或shVEGF强。3、转染CPNP-DNA对各组Lovo细胞的凋亡作用：流式细胞仪结果显示各组细胞凋亡率分别为：L1组1.92%,L2组5.57%,L3组43.8%,L4 20.2%,L5组67.8%,其中L5凋亡率最高,说明转染联合基因治疗体系pcDNA3.1(-)shVEGF/yCDglyTK对Lovo细胞的凋亡作用较单独转染自杀基因yCDglyTK或shVEGF强。结论：1、磷酸钙纳米颗粒能成功介导pcDNA3.1(-)Null. pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK、pGenesil-shVEGF、pcDNA3.1(-)shVEGF /yCDglyTK等四种质粒转染结肠癌Lovo细胞。2、yCDglyTK基因能有效抑制Lovo细胞的增殖,VEGF-shRNA能有效抑制VEGF的表达。3、联合基因治疗体系pcDNA3.1(-)shVEGF/yCDglyTK较单独的自杀基因治疗及RNA干扰更有效地杀伤结肠癌Lovo细胞。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
目录  10-12
英汉缩略词  12-13
第一章 前言  13-15
第二章 材料与方法  15-22
  2.1 仪器与试剂  15-18
    2.1.1 实验仪器与材料  15-16
    2.1.2 实验试剂及耗材  16-18
  2.2 实验设计  18-22
    2.2.1 RT-PCR检测CPNP-质粒DNA转染结肠癌Lovo细胞后yCDglyTK及VEGF基因mRNA的表达  18-19
    2.2.2 免疫荧光检测CPNP-质粒DNA转染结肠癌Lovo细胞后yCDglyTK及VEGF基因蛋白的表达  19-20
    2.2.3 CPNP-质粒DNA转染及前体药物5-FC处理对结肠癌Lovo细胞的增殖抑制作用  20-21
    2.2.4 CPNP-质粒DNA转染及前体药物5-FC处理诱导结肠癌Lovo细胞的凋亡作用  21
    2.2.5 实验分组  21
    2.2.6 统计分析  21-22
第三章 实验结果  22-31
  3.1 CPNP-质粒DNA转染Lovo细胞后MRNA的表达  22-24
    3.1.1 CPNP-质粒DNA转染后各组Lovo细胞yCDglyTK基因mRNA的表达  22
    3.1.2 CPNP-质粒DNA转染后各组Lovo细胞VEGF基因mRNA的表达  22-24
  3.2 CPNP-质粒DNA转染Lovo细胞后蛋白的表达  24-26
    3.2.1 CPNP-质粒DNA转染后各组Lovo细胞yCDglyTK基因蛋白的表达  24-25
    3.2.2 CPNP-质粒DNA转染后各组Lovo细胞VEGF的表达  25-26
  3.3 CPNP-质粒DNA转染及前体药物5-FC对结肠癌Lovo细胞的增殖抑制作用  26-27
  3.4 CPNP-质粒DNA转染及前体药物5-FC处理后结肠癌Lovo细胞的凋亡  27-31
第四章 分析与讨论  31-34
第五章 结论  34-35
参考文献  35-40
综述  40-55
致谢  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤
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