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烟草细胞质小分子热激蛋白HSP17.8基因的克隆及胁迫诱导表达特性分析

作　者: 李春子
导　师: 成善汉
学　校: 海南大学
专　业: 作物栽培与耕作学
关键词: 烟草小分子量热激蛋白基因克隆基因表达
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

植物一生极少在完全适宜的环境中生存,非生物胁迫越来越多影响植物的生长发育与栽培范围。小分子热激蛋白(sHSPs)是植物对外界胁迫所做的应答,是一类重要的胁迫诱导蛋白,在逆境胁迫下的表达增强可提高植物抗御各种逆境因子胁迫的能力,在植物与环境长期协同进化过程中起到非常重要的作用,将其作为逆境胁迫生理研究具有着重要意义。本研究采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)技术,从烟草幼嫩的叶片中分离克隆出烟草细胞质ClassⅠsHSPs基因,对该基因进行序列分析和功能预测,Northern杂交分析结果表明该基因受热激和干旱诱导表达。具体结果如下：1.克隆及序列分析：从烟草叶片中提取总RNA,根据已报道的烟草小分子热激蛋白基因片段的保守区域设计一对引物,利用RT-PCR技术获得446 bp基因的保守序列,然后根据该保守序列设计特异引物,利用RACE技术获得烟草细胞质ClassⅠsHSPs的cDNA全长序列(876 bp),该序列包含完整的编码序列(480 bp),编码159个氨基酸,推导肽链的分子量约为17.8 kDa,命名为NtHSP17.8。2.生物信息学分析：将该基因同其他小分子热激蛋白同源序列比对,结果表明该基因与细胞质calssⅠsHSPs家族聚类在一起,氨基酸序列分析该基因同其他植物的细胞质classⅠsHSPs高度同源,因此推测该基因为细胞质classⅠsHSP基因。对烟草小分子热激蛋白的二级结构和三维结构进行预测,二级结构一致性很高,三维结构也非常类似模板的过渡状态复合体晶体结构,其序列一致性约70%。3. Northern杂交：正常生长条件下烟草叶片中未检测到NtHSP17.8基因的转录产物,而在不同的高温或干旱单一胁迫处理的烟草叶中均检测到NtHSP17.8mRNA的积累,表明NtHSP17.8为热激和干旱诱导特异表达的基因。再对烟草苗单一胁迫(热激或干旱)与交叉胁迫(热激+干旱)相对照结果表明,交叉胁迫(热激+干旱)下NtHSP17.8表达量明显增加,表明NtHSP17.8的过量表达提高了烟草在温度逆境和干旱逆境下的抗性。4.胁迫诱导表达：归纳结果表明植物小分子热激蛋白蛋白在单一的胁迫条件下的表达情况已取得了很大进展,而在自然环境中经常遭遇的交叉胁迫还有待于进一步研究。三种植物相对而言,烟草体内的小分子热激蛋白的诱导表达还需要更深入的研究。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
1 文献综述  10-22
  1.1 课题提出的背景  10-11
  1.2 前人的研究进展  11-20
    1.2.1 烟草及其在植物研究领域中的应用概况  11
    1.2.2 热激蛋白  11-13
      1.2.2.1 热激蛋白的分类  11-12
      1.2.2.2 热激蛋白的功能  12
      1.2.2.3 热激蛋白基因的结构特征  12-13
    1.2.3 植物小分子热激蛋白(small heat shock proteins,sHSPs)  13-18
      1.2.3.1 植物小分子热激蛋白(sHSPs)的种类及其结构  13-14
      1.2.3.2 植物sHSPs的分子伴侣功能  14-15
      1.2.3.3 植物sHSPs的生成诱因  15-16
      1.2.3.4 植物小分子热激蛋白基因  16
      1.2.3.5 植物sHSPs基因的表达调控  16-17
      1.2.3.6 胁迫作用与小分子热激蛋白(sHSPs)  17-18
    1.2.4 全基因克隆技术  18-20
      1.2.4.1 cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)研究进展  18-20
      1.2.4.2 RACE技术的应用  20
  1.3 研究的目的与意义  20-22
2 材料与方法  22-39
  2.1 材料  22-23
    2.1.1 供试烟草  22
    2.1.2 菌种和质粒  22
    2.1.3 主要生化试剂与酶类  22
    2.1.4 试剂及溶液  22-23
    2.1.5 主要仪器  23
    2.1.6 供试软件  23
  2.2 实验方法  23-39
    2.2.1 烟草植株的获得  23
    2.2.2 烟草植株的处理  23-24
      2.2.2.1 用于克隆基因的烟草苗的热激处理  23-24
      2.2.2.2 用于分析烟草苗基因表达的逆境处理  24
    2.2.3 烟草NtHSP17.8基因片段的克隆  24-30
      2.2.3.1 扩增烟草NtHSP17.8基因片段的引物  24
      2.2.3.2 烟草RNA的提取  24-25
      2.2.3.3 第一链cDNA的合成  25-26
      2.2.3.4 烟草NtHSP17.8基因的cDNA片段PCR扩增  26
      2.2.3.5 琼脂糖凝胶上DNA片段的回收  26-27
      2.2.3.6 大肠杆菌感受态的制备  27-28
      2.2.3.7 克隆片段的连接、转化及测序  28-29
      2.2.3.8 质粒DNA的小量制备  29-30
    2.2.4 RACE方法克隆烟草NtHSP17.8基因  30-33
      2.2.4.1 5'-RACE获得目的基因的5'-端  30-31
      2.2.4.2 3'-RACE获得目的基因的3'端  31-33
    2.2.5 烟草NtHSP17.8基因序列生物信息学分析  33
    2.2.6 Northern杂交分析  33-39
      2.2.6.1 器皿和容器的处理  33
      2.2.6.2 RNA的提取  33-34
      2.2.6.3 探针制备  34
      2.2.6.4 标记结果的检测  34-35
      2.2.6.5 Northern-Blot  35-39
3 结果与分析  39-54
  3.1 烟草NtHSP17.8基因的克隆  39-45
    3.1.1 烟草NtHSP17.8的RNA提取结果  39
    3.1.2 烟草NtHSP17.8基因片段的扩增结果  39-40
    3.1.3 烟草NtHSP17.8基因的cDNA片段测序及比对结果  40-41
    3.1.4 5'-RACE扩增结果  41-43
    3.1.5 3'-RACE扩增结果  43-45
  3.2 生物信息学分析  45-48
    3.2.1 烟草NtHSP17.8基因全长cDNA的序列分析  45-46
    3.2.2 烟草NtHSP17.8二级结构预测  46-48
    3.2.3 烟草NtHSP17.8的三维结构  48
  3.3 植物小分子热激蛋白基因氨基酸序列比较与分析  48-51
  3.4 NtHSP17.8基因在不同胁迫条件下的表达差异  51-52
    3.4.1 热胁迫下NtHSP17.8在烟草叶中的表达  51
    3.4.2 干旱胁迫下NtHSP17.8在烟草叶中的表达  51-52
    3.4.3 交叉胁迫下NtHSP17.8在烟草叶中的表达  52
  3.5 植物sHSPs在各种胁迫环境下的表达归纳  52-54
4 讨论  54-57
  4.1 RNA提取与RACE的成败  54-55
  4.2 NtHSP17.8基因序列特征  55
  4.3 NtHSP17.8基因与胁迫抗性  55-56
  4.4 需继续开展的研究  56-57
5 结论  57-58
参考文献  58-63
附录  63-66
  附录1 主要仪器设备  63-64
  附录2 常用术语缩写与中英文对照  64-66
攻读硕士期间的主要研究成果简介  66-67
致谢  67

烟草细胞质小分子热激蛋白HSP17.8基因的克隆及胁迫诱导表达特性分析

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