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副猪嗜血杆菌生物被膜形成相关基因luxS和pilA的克隆和功能鉴定

作　者: 马艳平
导　师: 刘永生
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 副猪嗜血杆菌生物被膜同源重组基因缺失基因回复
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

细菌生物被膜(biofilm)是细菌黏附于异物和坏死组织表面,繁殖、分化并分泌大量胞外多聚基质包被其外形成的微菌落聚集体。研究细菌的生物被膜形成相关基因对于阐明细菌的慢性感染机制具有重要意义。目前对副猪嗜血杆菌全基因组序列测定已经完成,但对其生物被膜形成的相关基因及其功能研究还未见报道,根据密度感应信号和鞭毛基因可能与生物被膜形成有关的理论,本研究分离鉴定了一株生物被膜形成能力较强的副猪嗜血杆菌,分别构建了其密度感应信号相关基因luxS和鞭毛基因pilA的缺失突变株,并比较了缺失突变株与野生株生物被膜的形成能力。从甘肃、青海田间采集疑似副猪嗜血杆菌感染的病死猪组织,经细菌分离培养、生化试验和16S rRNA基因序列分析等共分离到6株副猪嗜血杆菌。将6株分离株与3株标准株经结晶紫染色和电镜观察,确定分离株HPS-LZ001有较强的生物被膜形成能力。各选取两株强生物被膜形成能力和两株弱生物被膜形成能力的副猪嗜血杆菌,分别采用微量肉汤稀释法和微量滴定板法进行浮游细菌和生物被膜对环丙沙星、氯霉素、卡那霉素的药敏试验,表明副猪嗜血杆菌形成生物被膜后,细菌耐药性明显提高。以副猪嗜血杆菌HPS-LZ001基因组DNA为模板,利用PCR技术分别扩增pilA基因,序列分析表明所克隆的pilA基因核苷酸序列与已发表的副猪嗜血杆菌序列(GenBank登录号：NC 011852),同源性分别为94%和87%。以HPS-LZ001基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增luxS基因上游687bp和基因中下游459bp的DNA序列,以及pilA基因上游468bp和基因下游579bp的DNA片段作为基因缺失突变载体的同源臂,利用重组PCR技术将两片段分别连接,然后连到自杀载体pDM4上构建出基因缺失突变载体pDM4-ΔluxS和pDM4-ΔpilA,分别转化入宿主菌E.coil S17-1λ。然后将E.coil S17-1λ-pDM4-ΔluxS和E.coil S17-1λ-pDM4-ΔpilA分别与副猪嗜血杆菌HPS-LZ001混合,涂布在TSA平板上进行接合转移,再传代于15%蔗糖TSA平板上去掉自杀载体,用PCR扩增目的基因和Southern Blotting进行鉴定,证明成功构建出副猪嗜血杆菌luxS基因缺失突变株和pilA基因缺失突变株。通过基因互补试验分别获得了luxS和pilA基因缺失突变回复株。用实时定量PCR技术对其转录水平进行了验证。分别对luxS、pilA基因缺失突变株和luxS、pilA基因缺失突变回复株进行生物被膜形成能力检测,结果表明这两个基因缺失突变株生物被膜形成能力与野生株相比明显降低,基因互补后生物被膜形成能力有一定回复,但没有达到野生株的水平。本研究利用同源重组方法分别构建了副猪嗜血杆菌HPS-LZ001的luxS基因和pilA基因缺失突变株和回复株,初步确定了副猪嗜血杆菌的luxS和pilA基因与生物被膜形成有关。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-13
第一章文献综述  13-23
  1.1 细菌生物被膜研究进展  13-18
    1.1.1 细菌生物被膜的形成机制研究  13
    1.1.2 细菌生物被膜形成功能研究  13-15
    1.1.3 细菌生物被膜形成相关基因及功能研究  15-16
    1.1.4 密度感应信号AI-2与生物被膜形成  16-18
  1.2 副猪嗜血杆菌研究进展  18-20
    1.2.1 病原学特性  18-19
    1.2.2 生理生化特性  19
    1.2.3 流行病学特征  19-20
  1.3 突变株构建方法研究  20-21
    1.3.1 自然诱变  20
    1.3.2 人工诱变方法  20
    1.3.3 分子生物学方法  20-21
  1.4 基因DNA水平和转录水平检测技术研究  21-22
    1.4.1 实时定量PCR(real-time PCR)  22
    1.4.2 Southern杂交  22
  1.5 本研究的目的及其意义  22-23
第二章副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其生物被膜形成能力检测  23-32
  2.1 实验材料  23
    2.1.1 实验菌株、培养基、实验质粒  23
    2.1.2 主要试剂  23
  2.2 方法  23-27
    2.2.1 溶液配制  23
    2.2.2 细菌分离培养  23
    2.2.3 细菌菌株的纯化  23-24
    2.2.4 染色镜检  24
    2.2.5 生化试验  24
    2.2.6 PCR鉴定方法  24-26
    2.2.7 副猪嗜血杆菌生物被膜形成能力检测  26-27
  2.3 结果  27-30
    2.3.1 细菌分离  27
    2.3.2 生化试验结果  27-28
    2.3.3 PCR反应结果  28-29
    2.3.4 副猪嗜血杆菌生物被膜形成能力检测  29-30
  2.4 讨论  30-32
第三章副猪嗜血杆菌生物被膜与耐药性关系分析  32-36
  3.1 实验材料  32
    3.1.1 实验菌株、培养基  32
    3.1.2 实验主要试剂  32
  3.2 方法  32-33
    3.2.1 生物被膜形成鉴定  32
    3.2.2 浮游细菌药敏试验  32
    3.2.3 副猪嗜血杆菌生物被膜药敏试验  32
    3.2.4 统计分析  32-33
  3.3 结果  33-35
    3.3.1 浮游细菌药敏试验结果  33
    3.3.2 副猪嗜血杆菌生物被膜药敏试验结果  33-35
  3.4 讨论  35-36
第四章副猪嗜血杆菌生物被膜缺失突变体的构建  36-69
  4.1 实验材料  36-39
    4.1.1 实验菌株、培养基、实验质粒  36
    4.1.2 菌种保存  36-37
    4.1.3 培养基、抗生素  37-38
    4.1.4 常规溶液、缓冲液配制  38
    4.1.5 试验中的引物  38-39
    4.1.6 主要仪器设备  39
  4.2 方法  39-56
    4.2.1 细菌培养  39-40
    4.2.2 HPS-LZ001基因组DNA的提取  40-41
    4.2.3 HPS-LZ001 luxS基因的扩增  41-42
    4.2.4 HPS-LZ001 pilA基因的扩增  42
    4.2.5 HPS-LZ001 luxS下游基因的扩增  42
    4.2.6 HPS-LZ001 luxS上游基因的扩增  42-44
    4.2.7 HPS-LZ001 pilA上、下游基因的扩增  44-45
    4.2.8 HPS-LZ001菌株luxS上下游基因的融合  45-46
    4.2.9 HPS-LZ001 pilA上下游基因的融合  46-47
    4.2.10 自杀质粒pDM4的提取,转化活化  47-48
    4.2.11 感受态细胞的制备  48
    4.2.12 HPS-LZ001菌株缺失突变体的构建  48-50
    4.2.13 基因缺失突变载体与HPS-LZ001菌株的同源交换  50-51
    4.2.14 HPS-LZ001ΔluxS缺失突变体luxS基因互补验证  51
    4.2.15 HPS-LZ001ΔpilA缺失突变体pilA基因互补验证  51
    4.2.16 缺失基因的DNA水平和基因转录水平鉴定  51-55
    4.2.17 生物被膜形成能力检测  55-56
  4.3 结果  56-67
    4.3.1 HPS-LZ001 luxS扩增结果  56-57
    4.3.2 HPS-LZ001 pilA基因扩增结果  57
    4.3.3 luxS基因缺失载体的构建  57-58
    4.3.4 pilA基因缺失突变载体的构建结果  58-59
    4.3.5 luxS基因突变载体与HPS-LZ001菌株同源交换结果  59-60
    4.3.6 pilA基因突变载体与HPS-LZ001菌株同源交换结果  60-61
    4.3.7 HPS-LZ001 ΔluxS菌株luxS基因互补结果  61
    4.3.8 HPS-LZ001 △pilA菌株pilA基因互补结果  61-62
    4.3.9 Southern杂交结果  62-64
    4.3.10 RT-PCR结果  64-65
    4.3.11 生物被膜形成能力检测结果  65-67
  4.4 讨论  67-69
第五章全文结论  69-70
参考文献  70-76
致谢  76-77
作者简历  77

副猪嗜血杆菌生物被膜形成相关基因luxS和pilA的克隆和功能鉴定

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