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BmCPV-SZ全基因组序列测定与分析及其多角体蛋白包装特性的研究

作　者: 孟祥坤
导　师: 朱越雄；贡成良
学　校: 苏州大学
专　业: 微生物学
关键词: 家蚕质型多角体病毒 基因组片段1-10 系统进化分析 多角体蛋白 lef-3
分类号: S884
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 35次
引　用: 1次
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内容摘要


家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cypovirus，BmCPV）是家蚕幼虫的病原微生物之一，可以引起家蚕中肠性脓病，给养蚕业带来很大的损失。对BmCPV基因组进行克隆与分析可以为深入研究该病毒基因组的功能以及致病机制提供依据，对于蚕病预防具有重要的指导意义。本研究对苏州分离到一株家蚕质型多角体病毒（命名为家蚕质型多角体病毒苏州株，Bombyx mori cypovirus Suzhou strain，BmCPV-SZ），通过病毒纯化、核酸提取、片段分离、RT-PCR和克隆，对该病毒全基因组序列进行了测定。为了解该病毒的进化起源和基因组编码蛋白的功能，利用生物信息学方法对基因组序列及编码蛋白进行了系统的分析。为了研究多角体蛋白对异源物质的包装机制，在对BmCPV-SZ基因组片段S10多角体蛋白基因（polh）进行克隆和序列分析的基础上，克隆到昆虫表达载体pIZT/V5-His，构建真核表达载体pIZT/V5-His-polh，然后转染BmN细胞，经Zeocin抗生素筛选获得了稳定表达的细胞系。根据PCR检测结果，确定polh已经在细胞中获得表达，同时细胞中可以观察到颗粒状结晶多角体的形成。用线性化病毒BmPACK6感染细胞，收集并纯化多角体经回感实验可以初步确定该蛋白可以对线性化杆状病毒BmPACK6进行异源包装。另外，研究还对小菜粉蝶颗粒体病毒lef-3基因进行了克隆和序列测定，并利用生物信息学方法对该基因及编码蛋白进行了分析。

全文目录


中文摘要  4-5
Abstract  5-11
第一部分 文献综述  11-31
  第一章 质型多角体病毒研究进展  11-24
    第一节 质型多角体病毒简介  11-16
      1.质型多角体病毒的发现  11-12
      2.病毒学分类  12-13
      3.质型多角体病毒类型  13-14
      4.病毒结构  14
      5.宿主及交叉感染  14-15
      6.病毒的入侵机制  15-16
      7.基因组结构及表达  16
    第二节 家蚕质型多角体病毒  16-20
      1. BmCPV的不同株系  16-17
      2. 基因组研究进展  17-19
      3. 研究意义  19-20
    参考文献  20-24
  第二章 多角体蛋白研究概况  24-31
    第一节 多角体的基本特征  24-25
    第二节 多角体蛋白基因  25-26
    第三节 多角体蛋白包装机制的研究  26-27
      1.多角体对病毒粒子的包装  26-27
      2.多角体对蛋白质的包装特性  27
    参考文献  27-31
第二部分 实验研究报告  31-101
  第三章 研究目的及内容  31-34
    1. 研究目的及意义  31-32
      1.1 蚕病预防  31
      1.2 生物杀虫剂  31-32
      1.3 病毒的进化起源  32
    2. 研究内容及技术路线  32-34
      2.1 主要研究内容  32
      2.2 主要的研究路线  32-34
  第四章 实验材料与方法  34-45
    1.实验材料  34-37
      1.1 材料  34
      1.2 工具酶及K it  34
      1.3 主要实验试剂与配制  34-37
    2.实验常用仪器设备  37-38
    3.常用方法  38-44
      3.1 CPV 多角体的纯化及基因组dsRNA 的提取  38
      3.2 dsRNA 片段1-10的分离纯化  38-39
      3.3 cD NA 合成及PCR 扩增  39
      3.4 连接反应  39-40
      3.5 感受态细胞的制备  40
      3.6 重组D NA 的转化  40
      3.7 碱裂解法制备质粒 DNA  40-41
      3.8 酶切反应  41-42
      3.9 BmN 细胞培养和保存  42
      3.10 BmN 的转染  42
      3.11 细胞基因组DNA 的提取  42-43
      3.12 电镜样品的制备  43-44
    参考文献  44-45
  第五章 BmCPV - SZ 全基因组克隆与分析  45-77
    1. 引言  45-46
    2. 材料与方法  46-49
      2.1 材料  46-47
      2.2 工具酶及K it  47
      2.3 CPV 基因组ds RNA 的提取  47
      2.4 Bm CPV ds RNA 片段的分离纯化  47
      2.5 RT - PCR 引物合成  47-49
      2.6 cDNA 合成及PCR 扩增  49
      2.7 克隆与鉴定  49
      2.8 序列分析  49
    3. 结果与分析  49-70
      3.1 BmCPV- SZ 基因组特征  49-53
      3.2 各片段的特点  53
      3.3 一致性比较  53-56
      3.4 RNA 末端比较  56-58
      3.5 编码蛋白的二级结构分析  58-61
      3.6 N 糖基化及磷酸化位点分析  61-63
      3.7 结构功能域分析  63-65
      3.8 系统进化分析  65-70
    4. 讨论  70-72
      4.1 CPV 的分类地位  70
      4.2 基因组片段 S1-S10 cDNA 合成  70-71
      4.3 系统进化分析  71
      4.4 末端序列比较  71
      4.5 蛋白质结构功能域分析  71-72
    参考文献  72-77
  第六章 多角体蛋白基因的表达及异源包装特性研究  77-88
    1. 引言  77-78
    2. 材料和方法  78-81
      2.1 材料  78
      2.2 方法  78-81
    3. 结果与分析  81-84
      3.1 重组质粒的酶切鉴定  81
      3.2 转染细胞的筛选  81-82
      3.3 稳定转染细胞基因组的P CR 鉴定  82-83
      3.4 多角体的纯化及包装特性的分析  83-84
      3.5 回感实验及X- G al 染色  84
    4. 讨论  84-86
    参考文献  86-88
  第七章 小菜粉蝶颗粒体病毒lef -3 基因的克隆与分析  88-101
    1. 引言  88-90
    2. 材料与方法  90
      2.1 材料  90
      2.2 方法  90
    3. 结果与分析  90-97
      3.1 序列分析  90-91
      3.2 Pira GVLEF-3 高级结构  91
      3.3 杆状病毒LEF -3 进化分析  91-95
      3.4 GVlef -3 基因的选择压力估计  95
      3.5 进化起源分析  95-97
    4. 讨论  97-98
    参考文献  98-101
结论  101-102
  1. 已取得的成果  101
  2.有待进一步研究的问题  101-102
附录一 Gen Bank 登录序列  102-103
附录二 硕士期间已发表文章  103-104
附录三 质粒图谱  104-105
致谢  105-106

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 蚕桑 > 蚕的病虫害及其防治
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