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淀粉酶产生菌的筛选及α-淀粉酶在米曲霉中的同源表达

作　者: 张建军
导　师: 施碧红
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 米曲霉 α-淀粉酶同源表达系统进化分析
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本研究为了获得α-淀粉酶高产菌株,做了两方面的工作。第一是从土壤中筛选高产淀粉酶菌株,并对其进行分子鉴定。第二是构建多拷贝α-淀粉酶表达盒的米曲霉工程菌株,以提高α-淀粉酶的产量,主要研究内容及结果如下:(1)从采自福州面粉加工厂附近的土壤中筛选到了14株淀粉酶产生菌。根据菌落形态判断,这14株菌均为霉菌。在淀粉-琼脂鉴定板上通过测定淀粉水解圈的大小,定性分析各株菌产淀粉酶的能力,发现菌株FS160产淀粉酶能力最强,克隆FS160的18S rDNA基因,测序并将序列提交GenBank(登陆号:FJ840490)。根据18S rDNA序列进行系统进化分析,发现其与烟曲霉(A.fumigatus)亲缘关系最近。(2)以米曲霉FS1125(Aspergillus oryzae FS1125)基因组DNA为模板,克隆了米曲霉α-淀粉酶表达盒序列和ITS序列,将测序结果提交GenBank(登陆号分别为:FJ859877和FJ859878)。将α-淀粉酶表达盒序列连接到ITS序列中间,再将融合序列ITS-amy连接到pBC-hygro载体上,构建了重组载体pBC-hygro-IA,然后用PEG-原生质体法将载体pBC-hygro-IA转化米曲霉FS1125原生质体,在含有潮霉素B的双层PDA培养基上筛选转化子,对挑选出的转化子进行基因组PCR验证,确定一株转化子成功整合了ITS-amy到基因组中。将这株转化子在含有潮霉素B的PDA选择性培养基上连续传代4次,获得了同核的米曲霉转化子,将其命名为:Aspergillus oryzae FS1125-T1。通过SDS-PAGE和Native-PAGE分析发现,米曲霉α-淀粉酶的分子量约为52kDa,并且米曲霉FS1125-T1比原始菌株FS1125液体发酵状态下α-淀粉酶表达量有明显提高。根据中温α-淀粉酶活性测定方法检测了米曲霉FS1125发酵液中的α-淀粉酶活性,米曲霉FS1125发酵液中α-淀粉酶活性最高出现在发酵96h时,酶活为4.5U/mL。同时研究了温度和pH值对α-淀粉酶活性的影响,α-淀粉酶的最适反应温度是50℃,最适反应pH值为5.0。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-4
中文文摘  4-9
第1章绪论  9-21
  1.1 微生物淀粉酶简介  9-14
    1.1.1 米曲霉中性α-淀粉酶简介  10-12
    1.1.2 黑曲霉耐酸性α-淀粉酶简介  12-14
  1.2 米曲霉简介  14-15
  1.3 米曲霉表达系统研究进展  15-19
    1.3.1 同源蛋白在米曲霉中的表达  15-16
      1.3.1.1 使用高效启动子提高蛋白产量  15-16
      1.3.1.2 增加编码基因拷贝数提高蛋白产量  16
      1.3.1.3 超表达曲霉来源的血红蛋白结构域(HBD)提高蛋白产量  16
    1.3.2 异源蛋白在米曲霉中的表达  16-19
      1.3.2.1 降低米曲霉蛋白酶活性  17-18
      1.3.2.2 使用高效启动子  18
      1.3.2.3 外源蛋白基因与米曲霉自身高分泌蛋白基因重组表达  18-19
  1.4 本课题研究的目的和意义  19-21
第2章淀粉酶产生菌的筛选及其系统进化分析  21-33
  2.1 前言  21
  2.2 材料与方法  21-25
    2.2.1 材料  21-22
      2.2.1.1 菌种  21
      2.2.1.2 培养基及试剂  21-22
      2.2.1.3 寡聚核苷酸引物  22
      2.2.1.4 主要仪器设备  22
    2.2.2 方法  22-25
      2.2.2.1 淀粉酶产生菌的筛选  22
      2.2.2.2 淀粉-琼脂鉴定板法测定发酵液淀粉酶活性  22-23
      2.2.2.3 丝状真菌基因组DNA提取方法  23
      2.2.2.4 E.coli JM 109感受态细胞的制备(CaCl_2法)  23-24
      2.2.2.5 丝状真菌18S rDNA基因的获得  24
      2.2.2.6 目的基因连接到pMD18-T载体  24
      2.2.2.7 转化E.coli JM109感受态细胞  24
      2.2.2.8 菌落PCR法验证转化子  24-25
      2.2.2.9 测序  25
      2.2.2.10 18S rDNA序列分析和系统进化树构建  25
  2.3 结果与讨论  25-31
    2.3.1 琼脂块法筛选淀粉酶产生菌  25
    2.3.2 发酵液中淀粉酶活性测定  25-27
    2.3.3 菌株FS160的18S rDNA基因序列的扩增  27-28
    2.3.4 18S rDNA基因与pMD18-T载体的连接及转化  28-29
    2.3.5 FS160的18S rDNA序列测定及分析  29-31
  2.4 小结  31-33
第3章多拷贝α-淀粉酶表达盒米曲霉工程菌的构建  33-53
  3.1 前言  33
  3.2 材料与方法  33-42
    3.2.1 材料  33-35
      3.2.1.1 菌种及载体  33
      3.2.1.2 培养基及试剂  33-34
      3.2.1.3 寡聚核苷酸引物  34-35
      3.2.1.4 主要仪器设备  35
    3.2.2 方法  35-42
      3.2.2.1 PCR扩增米曲霉FS1125 ITS序列和α-淀粉酶表达盒序列  35
      3.2.2.2 ITS和α-淀粉酶表达盒序列分别连接pMD18-T simple vector并测序  35-36
      3.2.2.3 重组载体pBC-hygro-IA的构建方法  36-37
      3.2.2.4 用质粒大量提取法提取pBC-hygro-IA  37
      3.2.2.5 pBC-hygro-IA转化米曲霉的方法(PEG-原生质体法)  37-39
      3.2.2.6 基因组PCR验证米曲霉转化子  39
      3.2.2.7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  39-41
      3.2.2.8 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和酶活性染色分析  41-42
  3.3 结果与讨论  42-51
    3.3.1 米曲霉FS1125 ITS序列和α-淀粉酶表达盒序列的克隆及序列分析  42-44
    3.3.2 重组载体pBC-hygro-IA的构建  44-46
    3.3.3 基因组PCR法验证米曲霉阳性转化子及同核转化子的获得  46-49
    3.3.4 SDS-PAGE检测米曲霉FS1125和米曲霉转化子FS1125-T1 α-淀粉酶的表达  49
    3.3.5 Native-PAGE和活性染色分析米曲霉FS1125和米曲霉转化子FS1125-T1 α-淀粉酶活性  49-51
  3.4 小结  51-53
第4章米曲霉FS1125所产α-淀粉酶的活性测定及其酶学性质的初步分析  53-59
  4.1 前言  53
  4.2 材料与方法  53-55
    4.2.1 材料  53-54
      4.2.1.1 菌种  53
      4.2.1.2 培养基及试剂  53-54
      4.2.1.3 主要仪器设备  54
    4.2.2 方法  54-55
      4.2.2.1 米曲霉发酵实验  54
      4.2.2.2 中温α-淀粉酶活性测定方法  54
      4.2.2.3 α-淀粉酶最适反应pH值测定  54-55
      4.2.2.4 α-淀粉酶最适反应温度测定  55
  4.3 结果与讨论  55-57
    4.3.1 米曲霉FS1125发酵过程中淀粉酶活性及pH值变化  55
    4.3.2 pH值和反应温度对米曲霉FS1125 α-淀粉酶活性的影响  55-57
  4.4 小结  57-59
结论  59-61
展望  61-63
参考文献  63-69
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  69-70
致谢  70-71
个人简历  71-72

淀粉酶产生菌的筛选及α-淀粉酶在米曲霉中的同源表达

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