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利用人工油体和植物油体表达人表皮细胞生长因子hEGF

作　者: 赵宏
导　师: 刘昱辉
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人工油体植物油体表达体系人表皮细胞生长因子
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

人表皮细胞生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)是存在于唾液、胃液、血液、尿液中的一种分泌肽,由53个氨基酸组成,分子量为6221Da,等电点为4.6,对热稳定,根据分泌方式可分为旁分泌和自分泌两种。人表皮细胞生长因子含3个分子内二硫键,这3个二硫键对其结构稳定和功能发挥起重要作用。hEGF与其受体的相互作用,介导了细胞内一系列至关重要的生理功能,调控细胞增殖、分化、迁移、生存等与细胞命运密切相关的过程,在细胞发育、伤口愈合、器官发育中发挥重要作用。hEGF在促进伤口和溃疡愈合方面具有显著作用,因此被广泛应用于医药和化妆品领域,但hEGF组织提取和化学合成都存在严重的不足,目前临床上应用的hEGF主要是利用基因工程表达和生产的。植物油体表达体系的原理是将目的蛋白的编码基因插在油体膜蛋白OLEOSIN基因的3’端,编码OLEOSIN-目的蛋白的基因会在转基因植物种子的油体上特异表达,利用油体亲脂疏水的特性,转基因植物种子经简单的粉碎-离心-回收上层油相-去油,即可获得重组的油体蛋白。植物油体表达体系具有融合蛋白易于分离,提取工艺简单,重组蛋白可在种子中长期稳定贮存、易于运输,无动物病毒污染,蛋白后修饰系统完善等诸多优点。国内外已利用该体系在转基因植物种子中表达了GUS、载脂蛋白A1,胰岛素和降钙素等。但植物油体表达体系作为植物生物反应器,仍然受到植物生长周期长的限制。近年来人们发现,油体的三个组成成分TAGs,PLs和OLEOSIN-s,可在体外重组形成稳定的人工油体,人工油体在结构和稳定性上与植物来源的油体无显著差别。将目的蛋白编码基因插入oleosin的3’端,在大肠杆菌中表达的重组OLEOSIN-目的蛋白,与磷脂和三酰甘油在体外重组形成人工油体,利用重组人工油体相经简单离心即可与水相分开的特性,可以实现目的蛋白的快速分离。人工油体表达系统的主要优点是目的蛋白生产周期短、蛋白易于纯化,可用于乳化剂和固定化酶生产等,但一方面该系统缺少蛋白后加工修饰系统,另一方面OLEOSIN是一种碱性、强疏水蛋白,OELOSIN与目的蛋白重组形成的新融合蛋白能否具有生物学功能,能否在E.coli中成功表达,并在体外重组形成人工油体,人工油体与植物油体是否有差异等均尚需实验研究。为此本论文以hEGF为目的蛋白,研究利用人工油体表达系统和植物油体表达系统,表达和生产目的蛋白的可行性,主要内容和结果包括:(1)按照植物偏爱密码子人工合成了hEGF的编码基因; (2)构建了3个hEGF的E.coli表达载体:hEGF/pET32a、OLEOSIN-hEGF/pET28a、OLEOSIN-hEGF/pET32a;构建了1个植物油体表达载体pESCV2301;(3) SDS-PAGE和Western分析发现:a. hEGF/pET32a [Rosetta-gamiTM2(DE3) pLysS ] IPTG诱导后,可检测到目的蛋白的表达,表达的hEGF蛋白主要以可溶形式存在; b. OLEOSIN-hEGF/pET28a[Rosetta 2(DE3)] IPTG诱导后,未检测到目的蛋白的表达;c. OLEOSIN-hEGF/pET32a[Rosetta-gamiTM2(DE3)pLysS]IPTG诱导后,可检测到OLEOSIN-hEGF融合蛋白的表达,表达的蛋白主要以包涵体形式存在。(4)利用AKATA亲和层析,分离获得hEGF蛋白,蛋白纯度大于80%,MTT法“细胞增殖实验”结果表明表达的hEGF蛋白可显著促进细胞增殖,具有生物学活性,活性与Sigma公司销售的hEGF基本相同;(5)人工油体体外重组实验结果表明E.coli中表达OLEOSIN-hEGF融合蛋白可在pH7.5的磷酸钠缓冲液中与橄榄油、磷脂酰胆碱重组形成油体,显微镜检发现,重组油体与油菜中提取获得的油体在结构,稳定性上无显著差别;(6)用农杆菌介导法,将OLEOSIN-hEGF融合蛋白基因转入油菜中双4号,获得转基因油菜3株,转基因油菜的分子检测正在进行,收获种子后可对转基因油菜中和E.coli中表达的OLEOSIN?hEGF进行各项比较。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章综述  14-28
  1.1 人表皮细胞生长因子  14-21
    1.1.1 人表皮细胞生长因子的特性  14-17
    1.1.2 人表皮细胞生长因子的生物生理活性及其应用  17-19
    1.1.3 人表皮细胞生长因子的制备  19-20
    1.1.4 EGF 的发展前景  20-21
  1.2 油体及油体膜蛋白  21-23
    1.2.1 植物油体及油体膜蛋白的形态学和功能  21-22
    1.2.2 油体的形成过程  22-23
  1.3 油体及油体蛋白的应用  23-28
    1.3.1 油体用作乳化剂  23-24
    1.3.2 植物油体表达体系  24-25
    1.3.3 人工油体技术  25-28
第二章材料与方法  28-37
  2.1 材料  28-29
    2.1.1 植物材料、载体与菌株  28
    2.1.2 试剂盒  28-29
    2.1.3 药品试剂  29
    2.1.4 实验仪器  29
    2.1.5 引物  29
  2.2 实验方法  29-37
    2.2.1 非融合蛋白原核表达载体的构建  29-32
    2.2.2 原核油体蛋白融合表达载体的构建  32-33
    2.2.3 带有重组质粒的 E.coli 菌株的获得  33
    2.2.4 在大肠杆菌中的诱导表达  33-34
    2.2.5 融合蛋白的 Western 分析  34
    2.2.6 不含油体蛋白的重组hEGF 的纯化  34
    2.2.7 油菜油体提取与人工油体的构建  34-35
    2.2.8 EGF 的生物活性分析  35
    2.2.9 OLEOSIN-hEGF 融合蛋白植物表达载体的构建与转化  35-37
第三章结果与讨论  37-69
  3.1 HEGF 的 E.COLI 表达载体的构建  37-43
    3.1.1 CBD 基因的扩增与pCBDT 的构建  39-41
    3.1.2 hEGF 的 E.coli 表达载体的构建  41-43
  3.2 OLEOSIN-HEGF 的 E.COLI 表达载体的构建  43-53
    3.2.1 E.coli 表达载体 OLEOSIN-hEGF/pET32a 的构建  43-49
    3.2.2 E.coli 表达载体 OLEOSIN-hEGF/pET28a 的构建  49-53
  3.3 原核表达载体的诱导表达  53-55
    3.3.1 hEGF 在大肠杆菌中诱导表达  53
    3.3.2 OLEOSIN-hEGF 在大肠杆菌中诱导表达  53-54
    3.3.3 目标蛋白存在形式的分析  54-55
  3.4 融合蛋白的生物信息学分析  55
  3.5 HEGF 目的蛋白的亲和纯化  55-56
  3.6 融合蛋白的 WESTERN 分析  56-57
  3.7 重组油体的构建 SDS-PAGE 分析及镜检  57-58
    3.7.1 融合蛋白人工油体的构建  57
    3.7.2 人工油体的显微镜分析  57-58
  3.8 生物活性分析  58-59
  3.9 OLEOSIN-HEGF 融合蛋白的植物表达载体的构建与遗传转化  59-66
    3.9.1 植物油体表达载体的构建  59-60
    3.9.2 植物油体表达载体的遗传转化  60-66
  3.10 讨论  66-69
    3.10.1 基因设计和载体构建  66
    3.10.2 融合蛋白的表达  66-67
    3.10.3 利用表达的融合蛋白在体外重组形成人工油体  67
    3.10.4 重组人工油体在包涵体复性领域的应用  67-69
第四章全文结论  69-70
参考文献  70-76
致谢  76-77
作者简历  77

利用人工油体和植物油体表达人表皮细胞生长因子hEGF

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