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肝脏干细胞分离培养及体外细胞因子调控的实验研究

作　者: 马俊勋
导　师: 方驰华
学　校: 第一军医大学
专　业: 肝胆外科
关键词: 肝脏干细胞 免疫组化 分离培养 超微结构 肝细胞生长因子 表皮细胞生长因子
分类号: R329.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


研究背景 干细胞(stem cell)是一类在整个生命活动中具有无限期自我更新能力的细胞。成体干细胞(audult stem cell)具有一定的生长期，其分化能力、自我更新、自我维持能力具有局限性，生存时间相对较短，仅能单向或双向分化，其重要特点之一是它不能分化成机体所有的三个胚层来源的细胞。大量研究证实成体肝脏内存在肝脏干细胞(Hepatic stem cell, HSC)，它们属于成体干细胞，不仅具有自我更新的能力还可以生成自身来源组织的所有特化的细胞，如胆管上皮细胞、肝实质细胞和肠道上皮细胞。HSC是研究肝细胞发育、生长、增生、再生、纤维化及癌变等生理和病理生理过程中不可缺少的关键角色，通过干细胞移植、生物人工肝及肝导向基因治疗，在多种肝病及肝脏相关疾病中发挥重要作用，因此HSC的相关研究成为了国内外的热点。但是目前HSC的定位、分离培养、体外调控都还存在一定的争议或困难。HSC的起源和定位怎样?如何进行简易的分离培养?体外分化增殖的条件是什么?为了阐明HSC的定位，我们采用3’-甲基-4-二甲基氨偶氮苯(3’-methyl dimethylamino azobenzene, DAB)诱导建立大鼠HSC增殖模型，通过病理和免疫组化的方法研究HSC的起源和定位；利用门静脉胶原酶灌注和梯度离心法从成体大鼠肝脏分离HSC，在体外进行培养，通过细胞相差显微镜摄影、细胞透射和扫描电镜摄影及测量细胞生长曲线来观察细胞的生物学特征；体外用肝细胞生长因子(Hepatic growth factor, HGF)和上皮细胞生长因子(Epidermal growth factor, EGF)进行干预，研究HSC增殖的初步机制。 目的 本实验旨在探讨HSC的起源和定位，探讨一种操作简单、费用节省，结果可靠的HSC分离培养方法，为体外分离培养提供一种可行的途径。同时对体外培养的干细胞进行细胞因子调控，为临床应用探索新的途径。 方法 1．大鼠HSC模型的建立及定位：选择DAB诱导模型并且通过病理和组织免疫组化的方法研究SD大鼠HSC的分布。 2.大鼠Hsc分离培养及超微结构观察:利用门静脉灌注消化和密度梯度离心法从成体大鼠肝脏分离HSC并进行体外培养，通过细胞相差显微镜摄影、细胞透射和扫描电镜摄影及测量细胞生长曲线来观察HSC的生物学特征。 3.HGF、EGF对体外培养大鼠的HSC增殖的影响:对分离的HSC用无血清培养基培养，分别加不同浓度的EGF、HGF及EGF联合HGF，应用四甲基偶氮哇盐(Mononuelear eell direeeytotoxieity assay，MTT)比色法，观察不同浓度和不同时间HGF、EGF及HGF和EGF联合对大鼠HSC增殖的影响。 结果 1.病理发现HSC出现于汇管区胆管上皮层;肝脏组织免疫组化发现CK18、CK19、CD34阳性细胞是HSC，定位于汇管区，说明汇管区的胆管上皮是有效的潜在的HSC池。 2.从喂养DAB的成体大鼠肝脏可分离培养出具有多潜能的HSC，在形态学上明显不同于肝细胞，在体外可有效增殖且保持未分化状态。 3.EGF、HGF均具有明显改善SD大鼠HSC体外无血清培养条件的作用，对HSC有促增殖作用，并呈浓度依赖性，两者有协同作用。 结论 1.DAB模型是一个操作简单、成本低、造模结果可靠的HSC增殖模型，HSC起源于汇管区; 2.利用门静脉灌注消化和密度梯度离心法可以从喂养DAB的成体大鼠肝脏分离培养出HSC: 3.HGF、EGF对HSC有促增殖作用，EGF在10 ng/ml、HGFZong/ml浓度时作用最强，两者有协同作用

全文目录


缩略词对照表  3-4
中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-13
实验部分  13-48
  第一部分 大鼠肝脏干细胞模型的建立及组织免疫组化定位  13-25
    (一) 材料与方法  13-15
    (二) 结果  15-16
    (三) 讨论  16-18
    (四) 参考文献  18-25
  第二部分 大鼠肝脏干细胞分离培养及形态学观察  25-38
    (一) 材料与方法  25-29
    (二) 结果  29-30
    (三) 讨论  30-32
    (四) 参考文献  32-38
  第三部分 HGF、EGF对体外肝脏干细胞增殖的实验研究  38-48
    (一) 材料与方法  38-40
    (二) 结果  40-42
    (三) 讨论  42-45
    (四) 参考文献  45-48
全文小结  48-49
综述  49-59
致谢  59-60
研究生期间发表论文  60-61
原创性声明  61

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学 > 人体细胞学
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