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非编码RNA在肝癌发生、发展中的功能及机制研究

作　者: 张铃
导　师: 孙树汉
学　校: 第二军医大学
专　业: 遗传学
关键词: 原发性肝癌蛋白质组学内质网应激 miRNA 长链非编码RNA 表观遗传学上皮-间质转化
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，是世界范围内肿瘤导致死亡的主要因素之一。80%的新发肝癌病例出现在发展中国家；虽然肝细胞癌（HCC）是中国癌症死亡的主要原因之一；然而，肝癌的发生也在其他国家缓慢的增加，尤其是在西方国家。尽管对于肝癌，局部治疗如手术和经导管动脉化学栓塞能够获得成功，但肝癌病人仍有很高的复发和转移率。这造成了肝癌患者肿瘤手术切除后复发频率高、预后极差。然而，HCC的复发或转移的分子机制在很大程度上仍然不是很清楚。一些报道显示，非折叠蛋白反应途径的激活与肝癌的临床预后有着一定的联系，肝癌中高水平的非折叠蛋白伴侣分子的表达同更高的肿瘤分级相关。并且，非折叠蛋白途径在体外活化后，改变了肿瘤细胞对化疗药物试剂的敏感性。内质网（endoplasmic reticulum，ER）是细胞合成分泌性及膜蛋白的场所。细胞中的蛋白在内质网被合成后，必须经过正确的折叠，而这就需要分子伴侣蛋白的协助。缺氧、营养剥夺，以及化疗药物所导致的应激能使得肿瘤细胞产生多余的非折叠蛋白，而这些额外产生的非折叠蛋白会聚集在肿瘤细胞的内质网上。于是，肿瘤细胞为了对抗这些应激反应而活化了非折叠蛋白途径（unfolded protein response，UPR）。非折叠蛋白途径是细胞为了恢复更适蛋白折叠环境的一连串的信号转导的级联效应。这种机制提示我们，非折叠蛋白途径能成为癌症细胞自我保护，不受不利环境条件影响的重要途径，从而促进了肿瘤的生长，以及在“恶劣环境”下的存活。另外，上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和间质-上皮转化（MET）也在癌症转移进程中发挥重要的作用。现有研究已发现EMT可能是肿瘤转移播散和治疗时获得抗药性的重要原因。在肿瘤细胞中发生的EMT，使之经过了遗传和表观遗传的变化，在基因的克隆生长和形成中，有利于局部肿瘤的发展，而这些变化，特别是通过影响癌基因和抑癌基因，也进一步调节了EMT通路。已有许多研究表明，miR-200家族能抑制细胞上皮-间质转化和肿瘤细胞迁移。癌细胞在EMT过程中，获得更强的侵袭的能力而由此增加了肿瘤转移使之最终发展成恶性程度更大的癌症从而危及生命。然而，癌细胞可能存在不均一的分布，一些细胞保留了许多上皮特征同时获得一部分间质的表型，一些上皮起源的细胞具有完全的间质细胞特性。最近的数据表明，一些表观遗传学的改变，如非编码RNA，组蛋白修饰和DNA甲基化，参与了癌症转移和恶性转化的过程。因此，我们的研究就从非编码RNA入手，阐述了微小RNA（microRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）与内质网应激和上皮-间质转化之间的联系，从而深入解释了各种表观遗传学机制在肝癌发生发展中的作用。本课题的第一部分就对microRNA-122与内质网应激非折叠蛋白通路的关系在肝癌细胞对化疗药物敏感性中的作用进行了深入的探讨。microRNA-122（miR-122）是肝中表达最丰富的microRNA之一，占所有miRNA总数的70％左右。一些研究表明miR-122对肝脏内环境稳定十分重要。miR-122在小鼠和人的正常肝细胞表达丰富，但在大多数HCC的细胞系中表达沉默或表达非常低。miR-122的表达丢失与肝分化表型，侵袭和肝内转移相关。最近，裸鼠体内模型证实了miR-122有抑制肿瘤和增强化疗药物疗效的作用。先前也有研究发现miR-122能通过p53非依赖的细胞凋亡途径影响肝癌细胞对阿霉素（DOX）的敏感性。但是，这种现象发生的详细机制尚不清楚。那些以前的研究结果都没有充分解释miR-122的这种抑癌和药物增敏的潜力。因此需要新技术和新方法来研究miR-122的复杂功能。如今，我们运用蛋白组学的方法来研究miRNA对蛋白质的广泛影响。在我们的研究中，因为在Huh7细胞中miR-122有相对较高水平的表达，所以我们在Huh7细胞中对miR-122进行抑制表达，然后再运用差异蛋白质组学的方法进行研究，结果发现，在肝癌细胞中抑制miR-122表达后，多个参与非折叠蛋白反应途径的分子发生了上调。并且，同时我们检测到在Huh7细胞中转染miR-122抑制剂抑制miR-122表达后蛋白PSMD10发生了上调。PSMD10已被证明可以上调葡萄糖调节蛋白78（GRP78），从而可提高Huh7细胞中非折叠蛋白折叠的能力，以促进其从内质网应激中恢复。由于非折叠蛋白反应通路在肿瘤生物学中具有重要的作用，因此我们对miR-122与内质网应激反应调控关系的机理进行了充分研究。我们的研究结果表明，miR-122至少或部分是通过非折叠蛋白通路的负向调控改变了肿瘤细胞的致瘤能力。这些结果都表明miRNA是肿瘤发生发展甚至耐药中都具有至关重要作用的调控因子。然而，随着对非编码RNA调控机制的深入研究，我们发现，除了miRNA外，另外还有一类非编码也参与到了RNA调控的网络中，lncRNA的发现使我们能够了解机体更多的“秘密”。我们的第二部分课题内容就探讨了lncRNA与上皮间质转化的关系和lncRNA与microRNA相互调控机制在肝癌转移过程中的作用。近来的报道发现lncRNA可以作为支架，帮助蛋白质到基因组DNA上定位，从而使相关基因表达发生改变。而我们在最近的研究中，也通过芯片筛选技术发现在人类B型肝炎病毒（HBV）相关的肝癌和相对应的癌旁组织中lncRNAs发生了异常表达。我们的研究结果也表明在肝癌组织中特异性表达的长链非编码RNA谱可以将癌组织和癌旁组织进行准确判别。在这些lncRNAs中，我们筛选到了如lncRNA-HEIH和H19这样的lncRNA,对肝癌的形成和进展发挥着潜在作用。我们的研究表明在肝癌组织中上调表达的长链非编码RNAlncRNA-HEIH可以和EZH2相互作用，引导PRC2复合物在基因组中定位而调控细胞周期相关基因的表达。并且研究结果还显示在肝癌组织中上调表达的lncRNA-HEIH与肝癌复发概率密切相关，该长链非编码RNA在肝癌组织中的表达量与病人的术后生存时间显著关联。而在过去的研究也已经显示了H19和包括肝癌在内的多种类型的癌症之间具有较强的关联。在HCC中，H19的表达通常由于异常的DNA甲基化和印迹丢失而发生改变。然而，H19和肝癌的预后及肝癌之间的关系仍是未知的。在我们的lncRNA芯片中，H19作为表达差异最为明显的lncRNA分子之一，被筛选了出来，我们发现H19可以通过上调miR-200家族，从而抑制肝癌晚期的肿瘤转移。miR-200是EMT过程中的明星分子，高表达的miR-200能够通过逆转EMT的发生，而抑制癌症细胞的转移。我们的研究中发现长链非编码RNAH19能通过组蛋白乙酰化调节miRNA-200的表达，起到相同的抑制癌细胞转移的作用。这不仅表明lncRNA可以与miRNA互相调控和协同作用于疾病的发展过程，同时也为肝癌治疗提供了新的靶向。总之，本研究应用基因芯片、蛋白质组学等手段对参与肝癌发生、发展过程中的功能性非编码RNA调控机制及组蛋白修饰等表观遗传调控方式进行了深入的探讨，为进一步理解该过程中纷繁复杂的信号通路提供了新的视角，为肝癌的诊断及治疗提供了新的研究靶点。

非编码RNA在肝癌发生、发展中的功能及机制研究

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