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长链非编码RNA在非IgA系膜增生性肾小球肾炎患者中的表达差异研究

作　者: 李欢
导　师: 眭维国
学　校: 广西师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 长链非编码RNA 系膜增生性肾小球肾炎 表观调控 转录 微阵列芯片
分类号: R692.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


背景：系膜增生性肾小球肾炎(Mesangial proliferative glomerulonephritis,MsPGN)是一种由自身免疫介导的原发性肾小球肾炎,被国际肾病及肾脏病理学会划分为Ⅱ型狼疮肾炎,其发病机制尚不清楚。根据免疫发病机理,可将MsPGN分为IgAMsPGN(肾小球系膜区免疫沉积物以IgA沉积为主)及非IgA MsPGN(在肾小球系膜区没有IgA沉积,non-IgA MsPGN)两大类。长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是非编码RNA的一种,其转录本长度大于200个核苷酸,但是没有翻译蛋白的能力。过去人们曾经认为lncRNA是转录过程中的副产物,没有什么功能。最近的研究显示,lncRNA有重要的调节功能,涵括了基因转录、翻译及表观调节多个过程。这些功能的发现,也使得科研人员将目光聚集到lncRNA在疾病的发病机制中的所起的作用上,并有了很多新的发现。目的：通过表达谱芯片技术研究non-lgA MsPGN患者及正常对照组在信使RNA(Message RNA,mRNA)和lncRNA(?)的表达差异,筛选出差异显著的lncRNA及其基因座附近协同变化的基因,从而探索lncRNA在non-IgA MsPGN发病机制中潜在的作用。方法：收集4例non-IgA MsPGN患者的肾皮质组织和一例正常对照组的肾皮质组织,经过细胞破碎液破壁和低俗离心后,通过TRIzol法分离提取总RNA,使用Nanodrop ND-1000紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量,然后将RNA经合成双链cDNA试剂盒制备为双链cDNA并用单色荧光标记,再与12x135K的特制芯片杂交,经Axon GenePix4000B仪扫描,得到的图像输入NimbleScan软件和Agilent GeneSpring软件进行调校和统计分析,输出芯片杂交的结果。这个结果再进行Gene Ontology(基因本体论,GO)、Pathway分析及mRNA与lncRNA基因座位置关联分析,从中找出与non-IgA MsPGN密切相关的lncRNA。最后,采用RT-PCR(?)(?)部分基因的芯片检测结果进行检测,验证基因芯片结果的可靠性。结果：经过折叠倍率过滤(fold-change filtering),使得显著差异表达的mRNA与lncRNA(?)内数据达到显著水平(P均<0.05)。发现检测mRNA转录本中有3095个约16.42%的编码转录本有显著的差异表达(fold-change≥4),其中1461个上调,1634个下调；检测的lncRNA转录本中有2846个约15.37%的长链非编码转录本有显著的差异表达(fold-change≥3),其中1431个上调,1415个下调。经GO、Pathway分析及mRNA与lncRNA基因座位置关联分析,发现有5个lncRNA在non-IgA MsPGN发病机制中有着重要的潜在作用：AF1180924、AK092233、 AK130579、AK023598、AK055915。结论：non-IgA MsPGN患者免疫功能的紊乱,细胞自我凋亡的信号传导以及对炎症介质的受体活性方面也失调。lncRNA可潜在调控与这些功能相关的基因,所以我认为lncRNA有可能在non-IgA MsPGN的发生发展过程中起到了重要的作用。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-8
第1章 引言  8-12
第2章 材料和方法  12-28
  2.1 研究对象  12
  2.2 实验材料  12-15
    2.2.1 基因芯片  12-13
    2.2.2 主要试剂及试剂盒  13-14
    2.2.3 主要仪器  14-15
  2.3 方法  15-28
    2.3.1 组织样本处理  15
    2.3.2 总RNA抽提实验  15-16
    2.3.3 RNA质量检测  16-17
    2.3.4 芯片的检测  17-24
    2.3.5 对差异表达的mRNA数据进行生物学途径分析(Pahway analysis)及基因本体论(Gene Ontology,GO)分析  24
    2.3.6 LncRNA与基因座临近编码mRNA的关联性分析  24-25
    2.3.7 Quantitative Real time RT-PCR对实验结果进行验证  25-28
第3章 实验结果  28-49
  3.1 组织抽提的总RNA定量及质量检测  28-29
    3.1.1 分光光度计NanoDrop ND-1000检测  28
    3.1.2 变性琼脂糖凝胶电泳测试抽提的总RNA  28-29
  3.2 NanoDrop ND-1000检测双链cDNA的浓度和质量  29
  3.3 NanoDrop ND-1000检测荧光标记的cDNA质量  29
  3.4 芯片杂交实验结果  29-33
    3.4.1 芯片杂交扫描图像  29-31
    3.4.2 图像的信号处理  31-33
  3.5 生物学途径分析及基因本体论分析  33
  3.6 LncRNA与基因座临近编码mRNA的关联性分析结果  33-40
  3.7 RT-PCR验证实验结果  40-49
第4章 讨论  49-53
  4.1 顺式反义lncRNAs(Cis-antisense lncRNAs)  49-50
  4.2 内含子lncRNAs(Intronic lncRNAs)  50-51
  4.3 启动子关联lncRNAs(Promoter-associated lncRNAs)  51
  4.4 差异表达的lncRNAs实验小结  51-52
  4.5 课题存在的不足  52-53
第5章 结论与展望  53-54
  5.1 结论  53
  5.2 展望  53-54
参考文献  54-59
攻读硕士期间发表的论文目录  59-60
致谢  60-61

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 泌尿科学（泌尿生殖系疾病） > 肾疾病 > 肾炎
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