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骨髓间充质干细胞对结直肠癌细胞HT-29增殖的影响

作　者: 孙小可
导　师: 张乐鸣
学　校: 宁波大学
专　业: 外科学
关键词: 骨髓间充质干细胞结直肠癌增殖
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：本论文旨在于应用骨髓间充质干细胞强大的自分泌、旁分泌功能，研究其分泌功能是否具备有效抑制肿瘤生长的能力。利用骨髓间充质干细胞培养液上清处理结直肠癌细胞HT-29，MTT法测定HT-29细胞的增殖情况；应用RT-PCR方法测定经处理后的细胞中p53、Bcl-2、PCNA、GSK-3基因的表达。探讨骨髓间充质干细胞体外抑制结直肠癌细胞生长的分子机制。方法：1，人类骨髓间充质干细胞的体外分离，培养。2，人类骨髓间充质干细胞的鉴定：①显微镜下观察细胞形态学特征；②流式细胞仪检测细胞表面标志物CD34、CD44、CD73、CD90、CD105的表达情况；③不同条件下诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞及脂肪细胞分化，测定其定向分化能力。3，收集骨髓间充质干细胞培养上清，用骨髓间充质干细胞培养上清处理结直肠癌细胞HT-29，骨髓间充质干细胞培养上清浓度分别为20%、40%、60%、80%、100%，MTT法测定处理24h、48h后结直肠癌细胞HT-29的增殖情况。4，提取骨髓间充质干细胞培养上清处理48h后的结直肠癌HT-29细胞RNA，RT-PCR测定p53、Bcl-2、PCNA、GSK-3基因的表达。结果：1，体外培养，原代细胞呈长梭形贴壁生长，形态均一，能快速扩增。2，流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面分子标志物CD44、CD73、CD90、CD105呈阳性表达，标志物CD34呈阴性表达；不同培养条件下骨髓间充质干细胞向骨细胞、脂肪细胞分化，验证了其多向分化的能力。3，MTT显示随着BMSC培养上清的浓度增高，HT-29细胞测定出的抑制率也随之增大；同等培养条件下，处理48h的HT-29细胞的抑制率大于处理后24h HT-29细胞的抑制率。4，RT-PCR测定p53、Bcl-2、PCNA、GSK-3基因表达。随着BMSC培养上清的浓度增高p53、GSK-3相对表达量也随之增加；而随着BMSC培养上清的浓度增高Bcl-2、PCNA相对表达量却逐步降低。结论：骨髓间充质干细胞培养上清在体外能有效地抑制结直肠癌细胞HT-29的增殖。p53、Bcl-2、PCNA、GSK-3参与了骨髓间充质干细胞培养上清抑制结直肠癌细胞HT-29增殖的过程。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
引言  9-11
1 实验材料  11-13
  1.1 主要试剂  11
  1.2 主要试剂的配制  11-12
  1.3 仪器与设备  12-13
2 实验方法  13-19
  2.1 骨髓间充质干细胞（BMSC）培养及鉴定  13-15
    2.1.1 BMSC 原代培养  13
    2.1.2 BMSC 传代及冻存  13-14
    2.1.3 BMSC 的表面标志物鉴定  14
    2.1.4 BMSC 诱导分化成脂肪细胞、骨细胞  14-15
  2.2 MTT 法细胞增殖程度测定  15
    2.2.1 复苏 HT-29  15
    2.2.2 BMSC 上清与 HT-29 细胞株共培养  15
    2.2.3 MTT 测定共培养后 HT-29 增殖情况  15
  2.3 RT-PCR 基因表达测定  15-18
    2.3.1 RNA 提取  15-16
    2.3.2 cDNA 合成  16-17
    2.3.3 实时定量 PCR 检测  17-18
  2.4 统计学处理  18-19
3 实验结果  19-27
  3.1 原代 BMSC 培养及表面标志物的鉴定  19-23
    3.1.1 原代 BMSC 培养  19
    3.1.2 BMSC 细胞表面标志物的鉴定  19-21
    3.1.3 BMSC 的诱导分化  21-23
  3.2 MTT 法测定 BMSC 培养上清对 HT-29 增殖的影响  23-24
  3.3 RT-PCR 测定 p53、Bcl-2、PCNA、GSK-3 基因表达  24-27
4 讨论  27-30
结论  30-31
参考文献  31-34
附录A 符号说明  34-35
综述  35-45
  参考文献  40-45
在学研究成果  45-46
致谢  46

骨髓间充质干细胞对结直肠癌细胞HT-29增殖的影响

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