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氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞癌基因蛋白抑制作用的探讨

作　者: 田毅
导　师: 何群
学　校: 中南大学
专　业: 生物学
关键词: 氨基甾体 慢性髓性白血病 K562细胞系 CML细胞 钙通道 Ras癌基因 TC10
分类号: R733.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：研究氨基甾体H42389对K562细胞系及CML细胞的增殖及分化作用,探讨氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞Ras癌基因相关蛋白的抑制作用。方法：通过细胞培养实验、集落培养实验、MTT实验观察氨基甾体H42389对K562及CML细胞抑制增殖作用；采用Wright染色,联苯胺染色,NBT染色和流式细胞术观察K562和CML细胞功能变化,评价氨基甾体H42389对K562和CML细胞的诱导分化作用；通过荧光分光光度计检测氨基甾体H42389作用于K562和CML细胞30分钟后胞内游离钙离子浓度的变化；通过Realtime-PCR检测氨基甾体H42389对K562和CML细胞钙通道蛋白mRNA表达的影响。结果：1.氨基甾体H42389对K562细胞和CML细胞增殖的影响。将氨基甾体H42389按设定浓度加入到K562和CML细胞中,经5天孵育,可以观察到：随着药物浓度的加大,细胞增殖抑制程度加重,细胞MTT的A492值有明显的下降趋势。2.H42389对K562细胞和CML细胞分化的影响。K562和CML细胞培养5d后,Wright染色,光镜下经氨基甾体H42389处理后的细胞与对照组比可见细胞体积变大,核浆比例减少,表现一定程度的分化。K562细胞内血红蛋白联苯胺染色显示,氨基甾体H42389作用5天后,联苯胺染色的A492值随着药物浓度的升高而增高；CML细胞NBT染色A492值在一定药物浓度(10-6mol/L～10-9mol/L)下呈现出剂量依赖关系。流式细胞仪分析显示,10-6mol/L的氨基甾体H42389作用于K562细胞4天后,细胞膜上CD71表面标记表达阳性率为79%；作用于CML细胞4天后,细胞膜上CD14表面标记表达阳性率为77%。3.氨基甾体H42389抑制K562细胞和CML细胞的增殖和诱导其分化作用的机制研究。(1)氨基甾体H42389对K562和CML细胞内游离[Ca2+]i的影响。10-6mol/L的H42389处理已用Fura-2/AM负载过的K562和CML细胞,孵育后上机检查结果显示,K562细胞对照组的荧光值是176.30±1.62,处理组为114.88±1.73；CML细胞对照组的荧光值是184.03±1.52,处理组为112.90±0.91。表明经药物处理后的K562和CML细胞内游离[Ca2+]i明显低于对照组。(2)Realtime-PCR检测氨基甾体H42389作用后K562和CML细胞钙通道蛋白mRNA的表达量变化。处理组和对照组K56细胞钙通道nRNA相对含量分别是2.45×10-3、5.59×10-3,结果说明H42389作用K562细胞后可明显下调钙通道mRNA;处理组和对照组CML细胞钙通道mRNA相对含量分别是2.24×10-3、5.74×10-3,结果说明H42389作用CML细胞后可明显下调钙通道mRNA;(3)Realtime-PCR检测氨基甾体H42389作用后K562和CML细胞TC10mRNA的表达量变化。处理组和对照组K56细胞TC10mRNA相对含量分别是2.17×10-2、6.65×10-2,结果说明H42389作用K562细胞后可明显下调TC10mRNA;处理组和对照组CML细胞钙通道mRNA相对含量分别是2.22×10-3、6.71×10-2,结果说明H42389作用CML细胞后可明显下调TC10mRNA;结论1.氨基甾体H42389能明显抑制K562细胞以及CML细胞的生长增殖,在一定药物浓度范围内呈现出浓度依赖关系。2.氨基甾体H42389能够明显诱导K562细胞向红系分化成熟以及诱导CML细胞向单核巨噬系分化成熟。3.氨基甾体H42389可使K562细胞以及CML细胞内游离钙含量显著下降。4.氨基甾体H42389具有促进有效下调K562细胞以及CML细胞钙通道蛋白mRNA表达的能力。5.氨基甾体H42389具有有效下调K562细胞以及CML细胞Ras癌基因相关蛋白TC10mRNA表达的能力。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-14
縮略词对照表  14-15
1 前言  15-18
2 材料和方法  18-30
  2.1 细胞系  18
    2.1.1 K562细胞系  18
    2.1.2 慢性髓性白血病细胞  18
  2.2 药物  18
  2.3 材料  18-19
    2.3.1 主要仪器  18-19
    2.3.2 主要试剂  19
  2.4 实验分组  19-20
  2.5 检测指标  20-29
    2.5.1 慢性髓性白血病细胞的生长状况  20
    2.5.2 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞生长状况的影响  20-21
    2.5.3 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞MTT值的影响  21-22
    2.5.4 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞集落产率的影响  22-23
    2.5.5 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞形态的影响  23
    2.5.6. 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞联苯胺染色及氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色的的影响  23-24
    2.5.7 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞膜表面标记的影响  24-25
    2.5.8 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞[Ca~(2+)]_i的影响  25-26
    2.5.9 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞钙通道蛋白mRNA的表达的影响  26-27
    2.5.10 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞Ras癌基因相关蛋白TC10mRNA的表达的影响  27-29
  2.6 统计学处理  29-30
3 实验结果  30-40
  3.1 慢性髓性白血病细胞的生长状况  30-31
    3.1.1 K562细胞系的生长状况  30
    3.1.2 CML细胞的生长状况  30-31
  3.2 抑制增殖检测结果  31-34
    3.2.1. 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞生长的影响  31-32
    3.2.2 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞MTT值的影响  32-33
    3.2.3 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞集落产率的影响  33-34
  3.3 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞分化的影响  34-36
    3.3.1 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞形态的影响  34-35
    3.3.2 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞联苯胺染色及氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色的的影响的影响  35-36
    3.3.3 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞膜表面标记表达的影响  36
  3.4 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞机理研究  36-40
    3.4.1 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞内游离[Ca~(2+)]_i的影响  36-37
    3.4.2 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞钙通道mRNA相对含量的影响  37-38
    3.4.3 氨基甾体H42389对慢性髓性白血病细胞Ras癌基因相关蛋白TC10mRNA的表达的影响  38-40
4 分析讨论  40-45
5 结论  45-46
附图  46-56
综述  56-64
参考文献  64-73
致谢  73

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 慢性白血病
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