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原代培养骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的建立及其机制研究

作　者: 穆颖
导　师: 王枫
学　校: 第四军医大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 骨骼肌细胞 棕榈酸(PA) 胰岛素 胰岛素抵抗(IR) 脂筏(LR) 实时荧光PCR 葡萄糖转运蛋白4(GLUT4) TC10 cbl
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


胰岛素抵抗（Insulin Resistance,IR）是指维持机体内正常血糖量的胰岛素浓度大于其生理浓度,表现为胰岛素的靶组织对内源性或外源性胰岛素的敏感性和反应性降低。长期胰岛素抵抗会引发一系列代谢性疾病,如肥胖病尤其是内脏型肥胖、糖调节受损、2型糖尿病、脂肪肝、高血压、冠心病、脂代谢紊乱等。胰岛素的主要功能是维持机体的血糖稳定,肝脏、脂肪组织和肌肉组织是其作用的三个主要靶器官。当机体对胰岛素的敏感性降低时,肝脏葡萄糖释放增加,糖原合成减少;而外周组织对葡萄糖的摄取能力降低。长期发生胰岛素抵抗时,部分原本在脂肪组织内沉积的脂质也可进入肌肉组织和肝脏,发生易位沉积。作为外周靶组织的骨骼肌而言,它是葡萄糖代谢的重要组织,也是机体胰岛素抵抗的主要原因。由于胰岛素抵抗机制的复杂性,所以现对胰岛素抵抗的发生的分子机制还有很大争议。游离脂肪酸（Free fatty acid, FFA）与胰岛素抵抗关系密切。脂肪酸是构成人体脂肪和类脂（磷脂、糖脂、类固醇等）的基本物质,具有重要的生理功能。FFA诱导的胰岛素抵抗伴有胰岛素信号传递通路多个环节表达或活性的异常如胰岛素与受体的结合能力降低、胰岛素受体、胰岛素受体底物以及磷脂酞肌醇激酶活性下降、葡萄糖转运体表达降低等。这些均被认为是FFA诱导胰岛素抵抗的可能机制。但是,胰岛素信号分子表达或活性改变的上游机制目前还不清楚。随着脂筏的被发现,人们开始关注小G蛋白TC10在胰岛素抵抗中的作用。脂筏是细胞膜上含有特殊脂质及特殊蛋白质的微域（microdomains）。脂筏中的主要脂质成分是胆固醇、鞘磷脂和神经节苷脂。其鞘磷脂有较长的饱和脂肪酸尾链,与胆固醇相互作用可形成一种有序脂质相（lipid ordered phase） ,这种结构比脂筏周围的胞膜区域具有更高的有序性和稳定性,介于无序液体与液晶之间,称为有序液体（Liquid-ordered）。有研究表明,脂筏参与了细胞内脂肪酸的跨膜转运。骨骼肌是机体能量代谢的主要组织,体内大多数碳水化物、脂肪都是在骨骼肌内进行能量代谢的,所以骨骼肌在胰岛素抵抗形成中可能具有重要的作用。本实验以原代培养的骨骼肌细胞为研究对象,通过观察棕榈酸,胰岛素诱导的细胞与正常培养的骨骼肌细胞对葡萄糖摄取的差异,确立了建立胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型的条件。并在此基础上进一步研究cbl、TC10、GLUT4 mRNA的表达的不同,为研究骨骼肌胰岛素抵抗提供机制性探讨;同时,研究脂筏在胰岛素信号传导中的作用,为胰岛素抵抗的研究机制提供一个新的契入点。实验方法1、细胞培养:本实验采用新生SD大鼠四肢进行原代骨骼肌细胞培养,并鉴定。2、建立棕榈酸和胰岛素诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型:按诱导因素的不同分为:正常对照组、胰岛素组(5×10-7、1×10-7 M)及棕榈酸组（0.25、0.4、0.6、1 mM）。将细胞接种于96孔板。待形成成熟的骨骼肌细胞后,加入无酚红的DMEM分别测2h、6h、12h、24h时培养液中所剩葡萄糖的浓度,随后将各组细胞一分为二,部分给予胰岛素刺激,再次检测培养液种葡萄糖的浓度,观察胰岛素的生理功效的变化。3、胰岛素抵抗骨骼肌模型中cbl、TC10、GLUT4mRNA表达丰度改变:依据抗性模型的培养条件分为正常对照组、胰岛素组(5×10-7、1×10-7 M)、不同浓度的PA（0.25、0.4、0.6mM,t=12）组、相同浓度（0.6mM）不同时间（6、12、24h）的PA组,采用qPCR方法分别检测各组中cbl、TC10、GLUT4mRNA表达丰度。4、脂筏结构对胰岛素信号传导的影响:用β-CD封闭细胞膜上的脂筏,利用透射电镜观察细胞膜上脂筏结构改变。将正常细胞和封闭组细胞均用insulin刺激20min,采用qPCR方法分别检测正常对照组和脂筏封闭组cbl、TC10、GLUT4 mRNA表达的丰度。实验结果1、原代骨骼肌细胞培养成功镜下可见肌管跳动,染色呈阳性。2、0.6 mM棕榈酸诱导12 h以上或者5×10-7 M胰岛素诱导24 h后,骨骼肌细胞基础糖转运和胰岛素刺激的糖转运与正常组相比均有所降低。胰岛素的生理功效降低,细胞对胰岛素产生耐受。3、采用qPCR法观察:1×10-7 M胰岛素与正常对照组相比低浓度胰岛素诱导的处理组cbl、TC10、GLUT4 mRNA相对丰度有所升高;而5×10-7 M浓度的胰岛素诱导的处理组cbl、TC10、GLUT4mRNA相对丰度显著降低。不同浓度不同时间的PA诱导组cbl、TC10、GLUT4mRNA相对丰度均低于正常对照组;且有时间—剂量依赖性。4、用β-CD处理骨骼肌细胞,电镜显示细胞膜上的脂筏封闭,采用qPCR发现脂筏封闭组较正常组cbl、TC10、GLUT4mRNA相对丰度表达降低。实验结论1、高浓度棕榈酸或高胰岛素均可诱导原代骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型。2、GLUT4作为骨骼肌细胞的摄取葡萄糖的限速蛋白,不仅受PI3K这一通路影响,而且受cbl、TC10的信号偶联作用,且PA诱导组有时间剂量依赖关系。3、当脂筏被封闭后,cbl、TC10的信号通路也会受到抑制,GLUT4mRNA表达丰度下降。

全文目录


英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-11
英文摘要  11-16
前言  16-19
文献回顾  19-37
  第一部分 胰岛素抵抗及胰岛素抵抗模型  19-23
  第二部分 脂肪酸与胰岛素抵抗  23-28
  第三部分 胰岛素生物学效应的信号传导通路  28-32
  第四部分 脂筏与脂肪酸的跨膜转运  32-37
实验内容  37-64
  第一部分 原代骨骼肌细胞的培养及鉴定  37-43
    1 实验材料  37-38
    2 试验方法  38-39
    3 实验结果  39-41
    4 讨论  41-43
  第二部分 棕榈酸及胰岛素对骨骼肌细胞糖代谢的影响  43-50
    1 实验材料  43-44
    2 实验方法  44-45
    3 实验结果  45-47
    4 讨论  47-50
  第三部分 高浓度棕榈酸、胰岛素对骨骼肌细胞中cbl TC10 GLUT4 mRNA 表达丰度的改变  50-58
    1 实验材料  50-51
    2 实验方法  51-53
    3 实验结果  53-56
    4 讨论  56-58
  第四部分 脂筏结构在骨骼肌细胞cbl TC10 GLUT4 信号转导中的作用  58-64
    1 实验材料  58
    2 试验方法  58-59
    3 实验结果  59-62
    4 讨论  62-64
结论  64-65
参考文献  65-75
个人简历和研究成果  75-76
致谢  76

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
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