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雷公藤内酯醇抑制人神经胶质母细胞U87细胞增殖和侵袭的作用及机制

作　者: 李建斌
导　师: 祝新根
学　校:
专　业: 外科学
关键词: 雷公藤内酯醇胶质瘤侵袭核因子NF-κB
分类号: R739.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：恶性神经胶质瘤是颅内恶性程度最高的肿瘤，具有浸润侵袭性生长的特性，手术难以完全切除，且易于复发，患者如果不接受治疗平均生存期仅几个月。目前临床上对神经胶质瘤采取手术、放疗、化疗、免疫等手段进行综合治疗，但患者预后不佳。侵袭是神经胶质瘤的标志性恶性生物学特性，也是神经胶质瘤预后差的重要原因。神经胶质瘤的侵袭受到多机制的调控，其中核因子κB (NF-κB)家族中P65的表达与神经胶质瘤的侵袭性具有显著相关性，激活NF-κB可促进CB和MMP-9转录，增强水解细胞外基质能力促进侵袭进程。因此NF-κB可以为抑制神经胶质的侵袭提供一个作用靶点。雷公藤内酯醇(triptolide)是从传统中草药中提取得单体化合物，临床上常作为免疫抑制剂治疗免疫系统疾病。近来研究发现雷公藤内酯醇对神经胶质瘤细胞具有抑制增殖、诱导凋亡的作用，但是对其是否具有抑制侵袭的作用还不得而知。本研究拟对triptolide处理过的神经胶质瘤细胞株U87进行检测，观察triptolide对U87细胞的增殖及侵袭能力的影响，并进一步研究triptolide抗侵袭作用的可能机制，初步探讨NF-κB信号通路与triptolide抗神经胶质瘤作用的关系，为将来把triptolide开发成为抗神经胶质瘤的药物提供理论基础。方法：1.通过甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）测定雷公藤内酯醇处理后U87细胞增殖抑制率；2.划痕实验和体外transwell小室模型检测雷公藤内酯醇对U87细胞迁移能力和侵袭能力的影响；3. Real-Time PCR分别检测雷公藤内酯醇对U87细胞的组织蛋白酶B（Cathepsins B CB）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）的mRNA转录水平的影响；4.蛋白印迹法检测雷公藤内酯醇对U87胶质瘤细胞的CB、MMP-9和p65蛋白活性的影响。结果：1、在U87细胞上雷公藤内酯醇以剂量-效应方式抑制胶质瘤细胞增殖，其IC50值是25.36μg·L-1。2、雷公藤内酯醇可减弱U87胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力，划痕实验：72h后对照组迁移细胞数45±3个，且细胞形态无改变，生长良好。雷公藤内酯醇组72h迁移细胞数11±2个细胞伪足变短，活力下降。Transwell侵袭实验：迁移穿过基质胶与滤膜侵袭入下室的U87细胞数为：对照组平均102.5±3.0个，雷公藤内酯醇组平均55.4±2.7个，雷公藤内酯醇作用后U87胶质瘤细胞的侵袭能力显著下降（P <0.05），有显著性差异。3、RealTime PCR:藤内酯醇处理24h后恶性胶质瘤U87胶质瘤细胞的CB、MMP-9基因的mRNA的表达较空白对照组均明显下降。CB和MMP-9的转录明显受到抑制，Cathepsins B基因和MMP-9基因的2-△△CT值分别是0.64和0.28（P<0.05）4、蛋白印迹法：24h后空白对照组相比雷公藤内酯醇组的p65蛋白活性明显被抑制，同时MMP-9、CB的蛋白水平也明显下降。结论：1.在体外，triptolide能抑制神经胶质瘤的增殖和侵袭。2.Triptolide抗神经胶质瘤侵袭的作用可以通过抑制p65蛋白活性来抑制NF-κB的转录活性，继而下调CB基因及MMP-9基因的表达，降低神经胶质瘤细胞迁移和水解细胞外基质的能力，阻碍肿瘤细胞迁移来实现。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第1章引言  10-14
第2章材料  14-20
  2.1 细胞  14
  2.2 主要试剂与耗材  14-15
  2.3 主要仪器与设备  15-16
  2.4 试剂配制  16-20
第3章方法  20-27
  3.1 U87 细胞的培养及实验分组  20-21
    3.1.1 细胞传代  20
    3.1.2 细胞冻存  20-21
  3.2 MTT 检测细胞增殖抑制率  21
  3.3 细胞显微镜下观察  21
  3.4 划痕法迁移实验  21-22
  3.5 体外侵袭试验(Invasion assay in vitro)  22
  3.6 蛋白免疫印迹  22-24
    3.6.1 细胞总蛋白的提取  22-23
    3.6.2 检测样品蛋白含量  23
    3.6.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS--PAGE)  23-24
  3.7 Real-Time PCR  24-26
    3.7.1 各组 U87 细胞总 RNA 的提取  24-25
    3.7.2 反转录反应（cDNA 的合成）  25
    3.7.3 RealTime PCR 扩增 CB、MMP-9 和内参β-actin  25-26
  3.8 统计方法  26-27
第4章结果  27-32
  4.1 倒置显微镜观察细胞形态  27
  4.2 细胞的增殖抑制率检测  27-28
  4.3 对 U87 胶质瘤细胞迁移运动能力的影响  28
  4.4 U87 细胞体外侵袭力的影响  28-29
  4.5 RealTime PCR 检测 U87 胶质瘤细胞 Cathepsins B、 MMP-9 基因表达的影响  29-30
  4.6 雷公藤内酯醇对 U87 细胞 NF-κB 信号通路的影响见图 4  30-32
第5章讨论  32-36
第6章结论与展望  36-37
  结论  36
  展望  36-37
致谢  37-38
参考文献  38-44
附图  44-46
攻读学位期间的研究成果  46-47
综述  47-53
  参考文献  51-53

雷公藤内酯醇抑制人神经胶质母细胞U87细胞增殖和侵袭的作用及机制

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