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SB203580对实验性蛛网膜下腔出血小鼠线粒体保护作用研究

作　者: 程习辉
导　师: 周文科
学　校: 新乡医学院
专　业: 神经外科学
关键词: SAH 线粒体 SB203850 凋亡
分类号: R743.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, S AH)致死、致残率高,后遗症多。其主要致死原因分为早期脑损伤(early brain injury, EBI)和脑血管痉挛(cerebral vasospasm, CVS)。长期以来,人们多认为CVS是影响SAH预后的主要原因,但以此为靶点的临床疗效却不尽人意。近年来研究发现SAH后EBI时期能够激活p38蛋白酶系统(p38mitogen-activated protein kinase, p38MAPK),这一过程不仅能够调控线粒体的结构和功能,还可诱发线粒体介导的凋亡途径导致细胞死亡。因此,在SAH后EBI时期通过抑制p38蛋白酶的激活系统可能为今后治疗SAH提供一个新的治疗靶点,以预防SAH后更严重的并发症。方法：生理盐水制作假手术组模型；氧和血红蛋白制备SAH模型；在SAH组模型制作成功30min后,再次注入SB203850(p38丝裂原蛋白激酶抑制剂,38MAPK抑制剂)或二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)液。然后检测各时间点(3h,6h,12h,24h,72h)出血侧大脑皮层的p38、ATP、Cytc、nNOS、LDH水平及神经细胞凋亡变化。结果：p38在假手术组未见阳性表达；在SAH组和DMSO组12h,24h出现阳性表达；在SB203580组12h,24h的阳性表达均减少,介于假手术组和SAH组(或DMSO组)之间,与之比较有显著差异(P<0.0001)。线粒体膜电位去极化在SAH组3h时间点变化明显、6h时达到最高峰,12h时开始有所下降,与假手术组相比有显著差异(P<0.0001)；在SAH组、DMSO组及SB203580组中除了DMSO3h时间点无统计学意义(P=0.3856)外,其它各时间点均显示线粒体膜电位去极化减少。ATP含量在SAH组3h时间点稍微下降,而6h时间点明显下降,并在12h时间点下降极为显著；SB203580组3h时间点的ATP水平开始增高,72h时达到一个更高的水平,SB203580组与SAH组仅在3h、72h时间点相比有显著差异(P=0.0012,P=0.0001)。Cyt c在假手术组出现一个较为稳定的中等表达水平；在SAH组中Cyt c阳性表达在所有时间点上明显增多,与假手术组相比有显著差异(P<0.0087);然而,在SB203580组各时间点中Cyt c又表现出一个中等表达水平,与SAH组或DMSO组相比均有统计学意义(P<0.0001),而与假手术组各时间点相比没有统计学意义(P>0.0851)。nNOS在SAH组中所有时间点上(除SAH后72h时外)的阳性表达明显增多,尤其是SAH后3h至12h期间,与假手术组相比有统计学意义(P<0.0001)；在SB203580组各时间点中nNOS表现出一个接近假手术组的表达水平,与假手术组各时间点相比没有统计学意义(P>0.0962),而SB203580组(除72h时间点外)与SAH组或DMSO组相比均有统计学意义(P<0.0001)。神经细胞凋亡数在SAH组随时间的延长其凋亡的阳性表达越多,在p38组各时间点(除3h外)的TUNEL阳性细胞数与SAH组或DMSO组同一时间点明显减少,有显著性差异,P<0.0001)。LDH活性在SAH组随着时间的越长其值越高,在SAH后72h达到高峰值,提示神经细胞的损伤程度随着SAH发作的时间延长越来越重。而SB203580组各个时间点变化不大。结论：SB203580通过抑制p38的表达,降低线粒体膜电位值,上调ATP含量,减少nNOS的表达及细胞色素c的释放,进而阻止线粒体功能异常,抑制细胞凋亡,发挥其神经保护作用。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-15
1. 材料  15-17
  1.1 实验动物  15
  1.2 主要试剂  15
  1.3 主要仪器设备  15-16
  1.4 主要试剂配制  16-17
2. 实验方法  17-23
  2.1 OxyHb制备  17
  2.2 SAH模型的制备  17-18
  2.3 石蜡切片制作  18
  2.4 小鼠脑组织的检测方法  18-22
    2.4.1 磷酸化p-p38的免疫组织化学法测  18-19
    2.4.2 线粒体膜电位检测  19-20
    2.4.3 ATP含量的检测  20
    2.4.4 细胞色素c(Cytc)的检测  20-21
    2.4.5 nNOS的免疫组化检测  21-22
    2.4.6 TUNEL检测  22
    2.4.7 LDH含量测  22
  2.5 统计学分析  22-23
3. 实验结果  23-27
  3.1 SB203580抑制SAH后皮层中p-p38的表达  23
  3.2 SB203580对SAH后皮层中线粒体的保护  23
  3.3 SB203580增加SAH后皮层中ATP.含量  23-24
  3.4 SB203580抑制SAH后皮层中Cytc向细胞质释放  24
  3.5 nNOS在各实验组不同时间点的检测变化  24-25
  3.6 SB203580抑制SAH后皮层神经细胞凋亡  25
  3.7 SB203580对SAH后皮层神经细胞的保护作用  25-27
4. 讨论  27-34
  4.1 SB203580抑制SAH后p-p38的表达  27
  4.2 SB203580抑制小鼠SAH后的皮层线粒体膜电位去极化  27-28
  4.3 SB203580在SAH后EBI时期促进ATP的生成  28
  4.4 SB203580在SAH后EBI时期起到神经保护作用  28-34
5.结论  34-35
参考文献  35-41
附图  41-50
综述  50-67
  参考文献  60-67
附录  67-69
攻读学位期间发表文章情况  69-70
致谢  70-71
个人简历  71

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