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硒对同型半胱氨酸诱导血管内皮细胞凋亡的影响

作　者: 卢振兴
导　师: 王梦洪
学　校: 南昌大学医学院
专　业: 内科学
关键词: 同型半胱氨酸血管内皮细胞凋亡活性氧硒
分类号: R589
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：血管内皮细胞是血管壁的天然屏障，具有重要的内分泌功能，它是心血管疾病的形成及发展中的重要角色。内皮细胞的凋亡被证实是心血管疾病的重要病理变化。同型半胱氨酸能够增加心血管疾病的风险，这与它诱导血管内皮细胞的凋亡有关。本实验旨在探讨硒能否缓解同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞凋亡及其机制。方法：①观察不同溶度同型半胱氨酸（Hcy）、铜（Cu）、硒（Se）对血管内皮细胞活性的影响分别以硫酸铜及亚硒酸钠为Cu和Se的来源，将实验分为正常组、Hcy组、Cu组及Se组，血管内皮细胞接种24小时后进行药物处理。Hcy组分别用100μM、250μM、500μM及1000μM溶度的Hcy处理细胞24小时；Cu组分别用5μM、10μM、15μM及20μM溶度的Cu处理48小时；Se组分别用100nM、300nM、500nM及1000nM溶度的Se处理细胞48小时。用CCK-8试剂盒检测药物处理后的各组细胞活性。②观察Cu和Hcy共同作用下血管内皮细胞活性的变化实验分为正常组、Cu+Hcy组，Hcy溶度分别为100μM、250μM、500μM及1000μM。血管内皮细胞接种24小时后用15μM溶度的Cu预处理12小时，然后用15μM溶度的Cu和各溶度Hcy共同作用细胞24小时。用CCK-8试剂盒检测药物处理后的细胞活性。③构建Cu和Hcy的血管内皮细胞损伤模型，探讨Se的干预作用将实验分为正常组，Cu+Hcy组，Cu+Hcy+Se组。细胞接种24小时后药物处理。后两组中Cu及Se预处理12小时，然后药物共同作用24小时。Cu、Hcy、Se溶度分别为15μM、500μM、100nM。对各组进行以下方面检测：CCK-8检测细胞活性，Annexin V-FITC检测细胞凋亡，检测活性氧水平，罗丹明123检测线粒体膜电位，测定谷胱甘肽过氧化物酶活性，测定caspase3及caspase9活性，qRT-PCR测定BaxmRNA及Bcl-2mRNA的表达。结果：⑴细胞活性与正常组比较，100μM的Hcy组细胞活性无明显变化（P>0.05）,其余各溶度Hcy组细胞活性更低(P<0.05)。各实验溶度的Cu作用细胞后与正常组比较细胞活性无明显变化(P>0.05)。与正常组比较，Se溶度为100nM时对细胞活性无明显影响(P<0.05)，其余更高溶度时细胞活性更低(P<0.05)，Cu+Hcy组与正常组比较细胞活性更低(P<0.05)。Cu+Hcy+Se组比Cu+Hcy组细胞活性更高(P<0.05)，Se能缓解Cu和Hcy导致的细胞活性降低。⑵细胞凋亡率与正常组比较，Cu+Hcy组及Cu+Hcy+Se组细胞的凋亡率均更高(P<0.05)。Cu+Hcy+Se组比Cu+Hcy组细胞凋亡率更低(P<0.05)，Se能够减轻Cu和Hcy诱导的细胞凋亡。⑶线粒体膜电位荧光强度高则膜电位高，Cu+Hcy组的荧光强度最低，正常组最高，Cu+Hcy+Se组位于两者之间。Se能缓解Cu和Hcy导致的膜电位下降。⑷活性氧水平与正常组比较，Cu+Hcy组及Cu+Hcy+Se组细胞活性氧的生成水平均更高(P<0.05)。Cu+Hcy+Se组活性氧的生成水平比Cu+Hcy组更低(P<0.05)，Se能缓解Cu和Hcy导致的活性氧生成的增加。⑸谷胱甘肽过氧化物酶活性与正常组比较，Cu+Hcy组的谷胱甘肽过氧化物酶活性更低(P<0.05)。Cu+Hcy+Se组比正常组及Cu+Hcy组酶活性均更高(P<0.05)，Se能缓解同型半胱氨酸和铜导致的酶活性下降。⑹caspase3及caspase9酶活性与正常组比较，Cu+Hcy组及Cu+Hcy+Se组细胞的两种酶的活性均更高(P<0.05)。Cu+Hcy+Se组比Cu+Hcy组两种酶活性更低(P<0.05)，Se能缓解Cu和Hcy导致的两种酶活性升高。⑺BaxmRNA及Bcl-2mRNA的表达①与正常组比较，Cu+Hcy组及Cu+Hcy+Se组细胞的BaxmRNA表达均更高(P<0.05)。Cu+Hcy+Se组比Cu+Hcy组BaxmRNA表达更低(P<0.05)，Se能减轻Cu和Hcy导致的BaxmRNA表达升高。②与正常组比较，Cu+Hcy组Cu+Hcy+Se组细胞的bcl-2mRNA表达更低（P<0.05)。Cu+Hcy+Se组比Cu+Hcy组bcl-2mRNA表达更高(P<0.05)，Se能缓解Cu和Hcy导致的bcl-2mRNA表达降低(P<0.05)。结论：①100μM溶度的Hcy不影响血管内皮细胞活性，更高溶度时细胞活性有所下降。②在15μM溶度Cu存在条件下，100μM到1000μM溶度Hcy均使得细胞活明显降低。③Se能够缓解Cu和Hcy诱导的血管内皮细胞凋亡。这可能与其降低活性氧的生成、提高谷甘胱肽过氧化物酶的活性、降低caspase3及caspase9活性有关，还可能与干预BaxmRNA及Bcl-2mRNA的表达有关。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-11
中英文缩略词  11-12
第1章前言  12-15
第2章实验材料和方法  15-28
  2.1 实验材料  15-16
    2.1.1 实验所用细胞  15
    2.1.2 主要试剂和药品  15-16
    2.1.3 实验主要仪器  16
  2.2 试验方法  16-27
    2.2.1 实验器材的准备  16-17
    2.2.2 相关液体的配置  17-18
    2.2.3 血管内皮细胞培养、细胞计数  18
    2.2.4 CCK-8 检测细胞活性  18-20
    2.2.5 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测  20-21
    2.2.6 活性氧的检测  21
    2.2.7 线粒体膜电位检测  21-22
    2.2.8 Bradford 法蛋白浓度测定  22
    2.2.9 Caspase9 活性检测  22-23
    2.2.10 Caspase3 活性检测  23-24
    2.2.11 谷胱甘肽过氧化物酶活性测定  24-25
    2.2.12 RNA 提取  25-26
    2.2.13 qRT-PCR 检测人血管内皮细胞株相关基因的表达  26-27
  2.3 统计学方法  27-28
第3章结果  28-40
  3.1 人血管内皮细胞（EC304）生长特点  28
  3.2 CCK-8 检测细胞活性  28-31
    3.2.1 单纯同型半胱氨酸对细胞活性的影响  28-29
    3.2.2 铜对血管内皮细胞活性的影响  29
    3.2.3 铜存在条件下同型半胱氨酸对血管内皮细胞活性的影响  29-30
    3.2.4 硒对内皮细胞活性的影响  30-31
    3.2.5 硒对同型半胱氨酸加铜诱导细胞损伤的干预  31
  3.3 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测  31-33
  3.4 氧自由基检测  33-35
  3.5 线粒体膜电位变化  35
  3.6 GPx 活性检测  35-36
  3.7 Caspase9 及 Caspase3 活性检测  36-37
    3.7.1 Caspase9 活性  36-37
    3.7.2 Caspase3 活性  37
  3.8 qRT-PCR 检测凋亡相关基因的表达  37-40
    3.8.1 BaxmRNA 表达  37-38
    3.8.2 Bcl-2 mRNA 表达  38-40
第4章讨论  40-44
第5章结论与展望  44-45
  5.1 结论  44
  5.2 展望  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-50
综述  50-57
  参考文献  55-57

硒对同型半胱氨酸诱导血管内皮细胞凋亡的影响

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