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HIF-1a siRNA对糖尿病大鼠视网膜VEGF抑制的研究

作　者: 孟丽珠
导　师: 陈松
学　校: 天津医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 糖尿病视网膜病变视网膜新生血管缺氧诱导因子血管内皮生长因子 RNA干扰基因治疗
分类号: R587.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的在血管生成过程中,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)被认为是一个最主要的调节因子。VEGF是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,能够促进内皮细胞的分裂增殖、迁移,增加血管的通透性。VEGF的表达受到多种因素的调节,其中组织的缺氧/缺血最为重要,VEGF的高表达主要是通过缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)诱导的。抑制其表达,可以减少视网膜VEGF的表达,进而减少新生血管(neovascularization,NV)的形成。本研究采用RNA干扰技术,构建HIF-1α siRNA重组质粒,以链尿佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的大鼠糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)模型为研究对象,探讨HIF-1α siRNA重组质粒对大鼠视网膜组织中VEGF表达的影响,评价其在糖尿病性视网膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)疾病中的治疗作用。方法本研究包括2部分：1.本研究采用随机对照研究。以pSilencer2.1-U6neo为质粒载体,构建针对大鼠的HIF-1α siRNA重组质粒,酶切、测序鉴定。体外培养恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A),脂质体LipofectamineTM2000介导分别转染空载体质粒和HIF-1α siRNA重组质粒。采用Western blot检测VEGF蛋白表达的变化。2.尾静脉注射STZ诱导建立大鼠DR模型,将大鼠随机分为糖尿病视网膜病变组(DR组)、空载体组和基因治疗组(HIF-1α siRNA转染组),正常对照组和DR组大鼠不做处理,空载体组和基因治疗组分别以脂质体LipofectamineTM2000介导玻璃体腔内注射pSilencer2.1-U6空载体质粒和HIF-la siRNA重组质粒。采用HE染色、FITC-dextran荧光造影视网膜铺片观察视网膜血管形态的变化,Real-time RT-PCR检测视网膜中VEGF mRNA的表达,免疫组织化学法检测视网膜VEGF蛋白的表达。采用SPSS13.0统计软件,组间数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.将合成的DNA序列退火后克隆到质粒载体上,经酶切、测序鉴定确定为所需序列。体外培养RF/6A细胞,转染HIF-1α siRNA重组质粒24h后,Western blot显示基因治疗组细胞内仅见极微弱的VEGF蛋白表达,而对照组VEGF蛋白表达相对明显,差异具有统计学意义(P<0.05),蛋白抑制率为54.9%。2.荧光造影视网膜铺片显示正常对照组视网膜血管从视盘发出,向四周放射状均匀分布。糖尿病大鼠视网膜可见大量微动脉瘤,血管呈串珠样改变,血管周围可见高荧光渗漏及大片无灌注区。实时荧光定量RT-PCR (Real-time RT-PCR)显示视网膜VEGF mRNA:正常对照组仅见弱的VEGF mRNA表达,而DR组表达明显上调,空载体组与DR组比较差异无统计学意义(P>0.05),基因治疗组较DR组明显减弱(P<0.05),VEGF mRNA抑制率24h、48h、72h、1w时分别为：32.8%、43.6%、47.7%、50.9%。HE切片显示：正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐,细胞形态基本正常。糖尿病大鼠视网膜各层细胞结构排列紊乱,节细胞、周细胞等各层细胞数减少,视网膜内血管扩张,内界膜不完整,血管内皮细胞增殖,新生血管芽、新生血管簇呈垂直状突破内界膜生长。免疫组织化学染色显示,VEGF阳性表达为细胞浆出现棕黄的颗粒,主要定位于神经节细胞层,少量位于神经纤维层、内核层及色素上皮层。正常对照组VEGF蛋白呈弱阳性表达,而DR对照组和空载体组表达明显增强,基因治疗组较DR组和空载体组表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF蛋白抑制率24h、48h、72h、1w时分别为：27.4%、40.6%、47.5%、64.5%。结论1.成功构建针对大鼠的HIF-1α siRNA重组质粒。脂质体介导HIF-1α siRNA重组质粒能有效抑制恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞VEGF蛋白的表达。2.成功构建糖尿病大鼠早期新生血管模型。采用脂质体介导,玻璃体腔内注射HIF-1α siRNA重组质粒能有效抑制糖尿病大鼠视网膜中VEGF mRNA及蛋白的表达。以HIF-1α为靶点的基因治疗有可能成为有效抑制糖尿病性RNV的新手段。

HIF-1a siRNA对糖尿病大鼠视网膜VEGF抑制的研究

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