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昆母汤对RA滑膜成纤维细胞增殖及细胞因子表达的影响

作　者: 林云斌
导　师: 林昌松
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中医学
关键词: 类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞昆母汤细胞因子
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎症为主要表现的自身免疫性疾病。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte, FLS)是滑膜组织的重要组成部分,其分泌高水平促炎性细胞因子、化学趋化因子、基质蛋白降解酶等,持续刺激滑膜细胞,作用于滑膜信号转导途径的不同部位,引起细胞内蛋白激酶的持续激活,从而导致滑膜信号转导异常以及滑膜细胞的增殖与凋亡失衡,引起关节的炎症和破坏。TNF-α具有多种生物活性,是一种重要的生理炎性介质,主要由单核巨噬细胞产生,通过作用于靶细胞上的独特受体结合而发生作用。TNF-α是RA发病机理中居于重要地位的促炎症细胞因子,参与RA的发生发展过程,能够刺激滑膜成纤维细胞增生及分泌IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、趋化因子IL-8以及基质金属蛋白酶(MMPs)和前列腺素(PGE2)等效应分子。在不同的组织中,TNF-α的生物学作用不同,TNF-α主要通过和不同细胞表面受体结合发挥其生物学作用。TNF-α两个受体为TNFRI和TNFRII,为肿瘤坏死因子受体家族,与TNF-α都有高度的亲和力,TNFRI胞内具有死亡结构域(death domain, DD),而TNFRII却不含死亡结构域。TNFRII缺乏DD序列,以抗细胞凋亡作用为主,它主要通过募集TRAFS信号分子激活多种信号传导通路,从而表达炎性细胞因子。临床研究证实,昆母汤具有抗炎、免疫调节作用,但对于RA滑膜细胞的影响,至今尚未见报道。为了进一步研究昆母汤对治疗RA的潜在应用价值,我们观察了不同浓度的昆母汤对TNF-α诱导的RA-FLS的影响.通过体外培养类风湿关节患者滑膜成纤维细胞,观察昆母汤对RA-FLS异常增殖的影响,以及TNF-α受体TNFRI和TNFRII的表达,相关炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、 MMP-3以及NO, iNOS, COX-2, PGE2的表达的影响,从体外培养滑膜细胞增殖和细胞因子表达的角度探讨昆母汤调控细胞因子的靶点和抗类风湿关节炎的作用机制,为昆母汤治疗RA的中医理论提供实验依据和开拓新途径。方法：1.类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的原代培养和传代鉴定：在无菌条件下取类风湿关节炎的滑膜组织运用两步消化酶法分离纯化类风湿关节炎滑膜细胞,传代后采用倒置显微镜和流式细胞技术表面抗体标记的鉴定,处于对数生长期的3-5代RA-FLS用于实验。2.四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测细胞生长的抑制率：体外培养RA-FLS细胞生长抑制率检测：取RA-FLS,按以下方法分成5组：空白组、甲氨蝶呤(MTX)阳性MTX组(含1μg/ml的MTX)和各剂量昆母汤组(分别含100,200,400μg/ml的昆母汤醇提物),干预后用MTT检测24h、48h、72h细胞增殖抑制情况。3.采用荧光定量RT-PCR法,检测各组细胞相关炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、 MMP-3、iNOS、COX-2、TNF受体TNFRI,TNFRII的mRNA表达：分为6组：空白组、TNF-α模型组、甲氨蝶呤(MTX)阳性MTX组(含1μ g/ml的MTX)和各浓度昆母汤组(分别含100,200,400μ g/ml的昆母汤醇提物)。除空白组,其余各组均加入TNF-α lOng/L,细胞培养24h后运用RT-PCR法检测mRNA表达情况。4.运用ELISA法检测上述各组处理后细胞培养液上清中的IL-1β、IL-6、IL-8、 MMP-3、PGE2的蛋白表达情况。5. Griess测NO法检测各组MTX组和昆母汤高中低剂量组上清液中NO的分泌水平。结果1.细胞培养实验,在倒置显微镜下可观察原代滑膜细胞生长情况,以成纤维细胞样细胞为主,细胞呈树杈型或多角形或梭形。滑膜组织分离纯化出的成纤维细胞进行流式细胞术表面标记的鉴定。结果显示CD14、CD3阳性率均小于2%、而CD90阳性率达93%以上。成纤维细胞纯度较高。2.MTT实验结果显示：MTT检测结果表明,随着干预时间的延长,各组RA-FLS的OD值增高而抑制率随着时间和剂量增多而逐步升高,呈现时间和剂量依赖性。加药干预24h时,各组RA-FLS和空白组对照,差异无统计学意义(P>0.05),增殖无明显抑制作用,当药物干预48h后,和空白组比较,低剂量昆母汤组无明显抑制作用差异无统计学意义(P>0.05), MTX、昆母汤中、高剂量组均可抑制RA-FLS的增殖,与TNF-α组相比,差异有显著统计学意义(P＜0.01),高剂量组对RA-FLS的抑制率差异有显著性(P＜0.01),抑制程度较MTX组高；72h后,各加药组均出现抑制作用,昆母汤不同剂量组随着药物浓度增加,抑制作用更为显著,呈剂量依赖性。低剂量组出现抑制作用,差异有统计学意义(P＜0.05),而MTX组、昆母汤醇提液中、高剂量组对RA-FLS的抑制程度明显,差异显著(P＜0.01夕。与低剂量组比较,中、高剂量组差异有统计学意义。各组细胞增殖率随着时间的延长,增殖率增高,抑制率也逐渐升高,在72h时,细胞增值率最高,而抑制率也是最高。在相同时间点,药物浓度越高,抑制率越高。MTX组抑制率介于中高剂量组之间。3.昆母汤对RA-FLS TNFRI和’TNFRII表达的影响半定量荧光PCR结果显示,TNF-α诱导后对各组TNFRII的mRNA表达均有促进作用,表达量增多,和空白组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。而TNFRI的mRNA表达均出现下降。药物干预24h后,低剂量组TNFRI和TNFRII的mRNA表达差异均无统计学意义(P＞0.05),而MTX、中、高剂量组TNFRII明显降低,TNFRI则略有升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。而MTX、高剂量组差异显著(P<0.01)。4.昆母汤对RA滑膜成纤维细胞相关细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8表达的影响RT-PCR结果显示：加入TNF-α诱导后各组IL-1β、IL-6、IL-8的mRNA表达量明显升高,和空白组比较,mRNA表达量其差异有统计学意义(P＜0.05),提示TNF-α均可诱导IL-1β、IL-6、IL-8mRNA的表达,在加药干预24h后,相对于TNF-α组,低剂量组IL-6、IL-8的RNA表达量差异没有统计学意义(P＞0.05),而对MTX组和中、高剂量组TNF-α组细胞IL-6、IL-8的RNA表达量均低于TNF-α组,说明均可抑制RNA表达量(P<0.05),差异有统计学意义,MTX、高剂量组差异显著(P<0.01)。对IL-6的作用,MTX介于中、高剂量组之间,而对IL-8的作用,高剂量组和MTX组相当。低、中剂量组对IL-1β的抑制作用不明显,差异无统计学意义(P>0.05),而MTX组、高剂量组均有显著差异(P<0.01)。ELISA检测结果显示,TNF-α诱导后对各炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8的蛋白表达均有促进作用,蛋白表达量增多,和空白组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。加入药物干预24h后,和TNF-α诱导组对比,低剂量组细胞培养上清IL-6、IL-8含量差异无统计学意义,中、高剂量差异有统计学意义(P<0.05), MTX、高剂量昆母汤不同剂量组明显降低(P＜0.01)。低、中剂量组对IL-1β蛋白表达影响和TNF-α组差异无统计学意义(P>0.05),而MTX组和高剂量组对IL-1β蛋白表达的抑制作用有差异显著性(P<0.05)。5.昆母汤对RA-FLS细胞因子MMP3表达的影响RT-PCR结果显示：TNF-α均可诱导MMP-3的mRNA的表达加入TNF-α诱导后各组的RNA表达量明显升高,各组对MMP-3的RNA抑制作用和TNF-α组对比,除低剂量组,其余各组具有显著差异,MTX中、高剂量组均有显著差异(P<0.01), MTX组与中剂量组作用相当,差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA检测结果显示,TNF-α诱导后对MMP-3蛋白表达均有促进作用,蛋白表达量增多,和空白组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。药物干预24h后,各组对MMP-3蛋白的抑制作用和TNF-α组对比,除低剂量组,其余各组具有显著差异,而中、高剂量组均有显著差异(P<0.01),MTX组与高剂量组作用相当,差异无统计学意义(P>0.05)。6.昆母汤对RA-FLS细胞因子NO和iNOS表达的影响各组NO检测结果显示：各组加入TNF-α诱导后各组的RNA表达量明显升高,和空白组比较,其差异有统计学意义(P<0.01)。在加药干预24h后,相对于TNF-α组,低剂量组NO量差异没有统计学意义(P>0.05),而对MTX组和中、高剂量组均低于TNF-α组,均可抑制NO,差异有统计学意义,且差异显著(P＜0.01)。荧光PCR检测结果显示：TNF-α均可诱导iNOS的分泌,表达加入TNF-α诱导后各组的RNA表达量明显升高和空白组比较其差异有统计学意义(P<0.05)。在加药干预24h后,相对于TNF-α组,低剂量组的RNA表达量差异没有统计学意义(P>0.05),而对MTX组和中、高剂量组TNF-α组细胞RNA表达量均低于TNF-α组,均可抑制RNA表达量,差异有统计学意义,且差异显著(P＜0.01)。7.昆母汤对RA-FLS细胞因子COX-2和PGE2表达的影响半定量荧光PCR结果显示,TNF-α诱导后对各组COX-2的mRNA表达均有促进作用,表达量增多,和空白组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。药物干预24h后,和TNF-α组对比,低剂量组COX-2的mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05),而MTX、中、高剂量组明显降低(P＜0.01)。ELISA检测结果显示,TNF-α诱导后对各组的PGE2蛋白表达均有促进作用,和空白组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。药物干预24h后,和TNF-α组对比,低剂量组细胞PGE2含量差异有统计学意义,而MTX、中、高剂量差异有统计学意义(P＜0.05)。结论昆母汤可抑制RA-FLS细胞的增殖和TNF-α诱导的细胞炎性因子IL-1β、IL-6, IL-8、MMP-3以及NO, iNOS, COX-2, PGE2的表达,抑制TNF-α和TNFRII结合,推测昆母汤可能通过抑制TNF-α和TNFRII结合,抑制细胞因子的产生,从而抑制阻断TNF-α介导的细胞增殖,滑膜炎症的增生和骨破坏。这为昆母汤治疗RA提供了实验基础和理论依据。

全文目录

摘要  3-7
Abstract  7-14
目录  14-16
引言  16-18
第一章文献研究  18-40
  第一节中医学对类风湿关节炎的认识与研究进展  18-23
    一、中医学对类风湿关节炎的认识  18-20
    二、中医学对RA的治法与研究进展  20-23
  第二节现代医学对类风湿关节炎的研究进展  23-35
    一、类风湿关节炎发病机制的研究  23-24
    二、滑膜细胞在RA病理中的作用  24-25
    三、RA病理过程中的细胞因子  25-35
    四、现代医学治疗RA的研究进展  35
  第三节昆明山海棠及益母草的研究进展  35-40
    一、昆明山海棠的研究进展  35-37
    二、益母草的研究进展  37-38
    三、中药配伍增强疗效减少毒副作用  38
    四、昆明山海棠配伍益母草在临床治疗RA中的意义  38-40
第二章昆母汤对RA滑膜成纤维细胞增殖和相关细胞因子表达的影响  40-73
  第一节昆母汤提取液的制备  40-41
    一、试剂与器材  40
    二、实验方法与步骤  40
    三、结果  40
    四、讨论  40-41
  第二节类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的原代分离培养及其鉴定  41-48
    一、试剂与器材  41-42
    二、实验方法与步骤  42-44
    三、结果  44-47
    四、讨论  47-48
  第三节昆母汤对类风湿关节炎成纤维滑膜细胞增殖的影响  48-53
    一、试剂与器材  48
    二、实验方法与步骤  48-49
    三、结果  49-51
    四、讨论  51-53
  第四节昆母汤对RA-FLS TNFRⅠ和TNFRⅡ表达的影响  53-57
    一、试剂与器材  53-54
    二、实验方法与步骤  54-55
    三、结果  55-56
    四、讨论  56-57
  第五节昆母汤对RA滑膜成纤维细胞相关细胞因子表达的影响  57-73
    一、试剂与器材  57-58
    二、实验方法与步骤  58-59
    三、结果  59-66
    四、讨论  66-73
结语  73-75
  一、结论  73
  二、创新点  73
  三、不足  73-74
  四、展望  74-75
参考文献  75-82
附录  82-88
在校期间发表论文情况  88-89
致谢  89

昆母汤对RA滑膜成纤维细胞增殖及细胞因子表达的影响

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