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小白菊内酯及其衍生物对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖及NF-κB、MCP-1表达的影响

作　者: 贾倩倩
导　师: 魏连波
学　校: 南方医科大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 小白菊内酯衍生物糖尿病肾病核因子-κB 单核细胞趋化蛋白-1
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着现代社会的发展和人们生活水平的提高,糖尿病(Diabetes mellitus, DM)发病率在世界范围内急剧上升。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是DM患者最常见也是最严重的微血管并发症之一,是导致终末期肾病的最主要的病因。目前,DN的发病机制尚不完全清楚,仍缺乏有效的治疗方法。因此,如何有效地预防并治疗DN已成为临床中的难题。DN的病因尚未完全阐明,目前认为是多种病因所致。发病与遗传、自身免疫和环境有关。DM是全世界流行的一种代谢性疾病,而DN是糖尿病最常见的并发症,在西方国家其已成为导致慢性肾衰竭的最主要原因。肾小球系膜细胞增殖、细胞因子大量分泌和细胞外基质的堆积在DN肾小球硬化中发挥了重要作用。高血糖是DN患者糖代谢紊乱的标志。DN的基本病理改变是肾小球血管功能障碍和细胞外基质的堆积,导致肾小球基底膜增厚,肾小球硬化和功能缺失。促炎因子的刺激导致系膜细胞的增殖和细胞外基质的堆积并分泌许多促炎因子,因此肾小球系膜细胞是糖尿病肾病的靶细胞,炎症是糖尿病及其并发症的发病机理。DN的发生严重影响了国民健康,并给国家和社会带了沉重的经济负担和社会负担,因此,寻求DN的病因病机,探索新的积极有效的治疗措施迫在眉睫。高血糖是DN发病的始动和中心环节,严格控制血糖可减少及延缓DN的发生和发展。细胞核因子KappaB(NF-κB)是一个复杂地广泛分布于许多细胞类型的转录因子,肾小球系膜细胞也不例外。NF-κB对信号传输和基因表达在炎症反应过程中起重要作用。受高血糖的影响NF-κB被激活,这是形成许多炎性因子如粘附分子和促炎细胞因子的原因,其中炎症性细胞因子核因子-κB(Nuclear factor-kappa B, NF-κB)及单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)起重要的介导作用。IκBα是转录因子NF-κB的抑制剂,它能控制免疫和炎症反应。NF-κB由于IκBα蛋白的存在在细胞质中处于静止状态,许多细胞外免疫刺激物可以诱导IκBβ激活通过受体介导途径,导致IκBα磷酸化和降解,而导致NF-κB被激活。激活的NF-κB进入细胞核并促进促炎细胞因子的释放。过度表达的促炎因子是导致DN的另一个重要因素。因此,研究PTL对高糖诱导的大鼠肾小球MC NF-κB活性和炎症因子MCP-1的表达的抑制作用,在DN的治疗过程中可能具有重要作用,对延缓DN的发展可能具有重要的临床意义,但作用机制尚有待更深一步的研究。目前临床治疗DN主要是通过控制高血糖、控制高血压、降低蛋白尿、限制蛋白的摄入及纠正脂代谢紊乱和抗炎等措施对症治疗,至今没有能发现完全阻断DN进一步发展的药物。因此,积极探求治疗DN的有效措施,对防止或延缓DN的发展具有重要的意义。小白菊内酯(parthenolide)是从菊科植物中提取出的倍半萜烯内酯类化合物,在民间曾被广泛用于发热、关节炎和偏头痛等多种炎性疾病。本实验以大鼠肾小球系膜细胞为实验研究对象,观察小白菊内酯对高糖诱导系膜细胞NF-κB活性及MCP-1表达的抑制作用,探讨小白菊内酯对糖尿病肾病可能产生的保护作用,以便为其临床应用提供理论及实验依据。具体如下：第一部分高糖对大鼠肾小球系膜细胞增殖、单核趋化蛋白-1表达及NF-κB活化的影响目的探讨高糖环境对大鼠肾小球系膜细胞增殖、单核趋化蛋白-1(MCP-1)的表达及NF-κB活化的影响。方法将体外培养大鼠肾小球系膜细胞(MC)分为3组：正常糖对照组NG(含5.6mmol/L葡萄糖)、高糖1组(含15mmol/L葡萄糖)、高糖2组(含20mmol/L葡萄糖)和高糖3组(含25mmol/L葡萄糖)。MTT法检测细胞的增殖情况,]ELISA法检测MCP-1的表达,Western Blot法检测IκBα以反映NF-κB的活性。结果与正常糖对照组相比,高糖环境下24h后细胞增殖明显,MCP-1表达明显增强(P<0.05)。高糖刺激30min后,NF-κB结合蛋白]IκBα明显降解,提示高糖可诱导MC NF-κB活化。结论高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞的增殖及炎症因子MCP-1的高表达可能是通过NF-κB的活化来实现的。第二部分小白菊内酯对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖及NF-κB MCP-1表达的影响目的探讨小白菊内酯(PTL)对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(MC)增殖、核因子-κB(NF-κB)活性和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法采用正常葡萄糖组(糖浓度为5.6mmol/L)和高糖组(糖浓度为30mmol/L).高糖+PTL组,分别体外培养大鼠肾小球MC, MTT法检测MC的增殖,ELISA法检测培养液上清中MCP-1的浓度,Western Blot法检测IκBα反映NF-kB的活性,：EMSA法检测NF-κB的活性。结果高糖诱导后MC增殖、MCP-1表达和NF-κB活性明显增强,NF-κB结合蛋白IκBα明显降解；应用PTL干预后,MC增殖、MCP-1表达和NF-κB活性均明显降低,IκBα降解被抑制。结论PTL能抑制高糖诱导的肾小球MC NF-κB活化及MCP-1的表达,从而为PTL用于临床防治糖尿病肾病提供了一定的理论依据。第三部分小白菊内酯衍生物对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞NF-κB活性和MCP-1表达的抑制作用目的探讨自主合成的小白菊内酯(PTL)衍生物MCL、LJ-5-42、ZJD-3-35a、ZJD-4-26a、CY-5、ZJD-3-35b、ZJD-3-lld、ZJD-2-24和ZJD-4-20对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(MC)核因子-κB(NF-κB)活性及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法高糖(糖浓度30mmol/L)MC诱导,分别用PTL及其衍生物MCL. LJ-5-42、ZJD-3-35a、ZJD-4-26a、CY-5、ZJD-3-35b、ZJD-3-lld、ZJD-2-24和ZJD-4-20进行干预。MTT法检测MC的增殖,ELISA法检测培养液上清中MCP-1的浓度,实时定量PCR测定MCP-lmRNA含量,Western Blot法检测IκBα, EMSA法检测NF-κB的活性。结果高糖诱导后MC增殖、MCP-1表达和NF-κB活性明显增强,NF-κB结合蛋白IκBα明显降解；应用PTL及其衍生物MCL、LJ-5-42、ZJD-3-35a、 ZJD-4-26a和CY-5干预后,MC增殖、MCP-1表达和NF-κB活性均明显降低,IκBα降解明显被抑制。结论PTL衍生物MCL、LJ-5-42、ZJD-3-35a、ZJD-4-26a和CY-5能显著抑制高糖诱导的大鼠肾小球MC IκBα蛋白降解和NF-κB活化,减少炎症因子MCP-1的生成,在DN的防治过程中可能具有重要作用,对延缓DN的发生发展可能具有重要的临床意义,但确切的作用及其机制尚有待更深一步研究。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-15
前言  15-22
  参考文献  19-22
第一章高糖对大鼠肾小球系膜细胞增殖、单核趋化蛋白-1表达及NF-κB活化的影响  22-28
  1 材料和方法  22-24
  2 实验结果  24-25
  3 讨论  25-26
  参考文献  26-28
第二章小白菊内酯对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞NF-KB活性及MCP-1表达的抑制作用  28-44
  材料和方法  28-38
  讨论  38-40
  参考文献  40-44
第三章小白菊内酯衍生物对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞NF-κB活性和MCP-1表达的抑制作用  44-56
  1 材料和方法  45-47
  2 结果  47-51
  3 讨论  51-53
  参考文献  53-56
综述  56-64
  参考文献  61-64
全文小结  64-66
攻读硕士学位期间取得的成果  66-67
中英文对照缩略词表  67-68
致谢  68-70

小白菊内酯及其衍生物对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖及NF-κB、MCP-1表达的影响

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