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家蚕“明”死卵突变体l-e~m基因的定位克隆及功能研究

作　者: 陈安利
导　师: 赵巧玲
学　校: 江苏科技大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 家蚕 l-em突变体定位克隆功能鉴定
分类号: S881.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

家蚕是一种完全变态昆虫，以卵滞育，可以说卵是家蚕生命周期中的第一个发育阶段，蚕卵品质的好坏直接影响到幼虫、蛹和成虫的发育。正常卵通常呈短椭圆形、侧面扁平且有轻微凹陷。本课题研究对象“明”死卵突变体（lethal egg of“ming”, l-em）是在实用品种“苏·菊×明·虎”母本品系“明”的生产和保存过程中发现的一种死卵突变体，在产卵后一小时左右出现三角形凹陷，表现失水死亡特征；遗传分析发现该突变由一对隐性基因控制，纯合致死，遵循伪母性遗传规律；扫描电镜观察突变体卵壳，发现卵壳表面凹陷处小室的边缘有明显的裂纹，卵壳纵断面中间层亦出现不连续的裂缝。本研究在对l-em卵突变体遗传分析及表型观察的基础上，采用图位克隆技术对l-em基因进行了定位克隆，采用qRT-PCR、2-DE、RNAi等技术对候选基因进行表达分析和功能验证。主要研究结果如下：一、l-em基因的定位选择l-em卵突变体隐性纯合的雄性亲本（P1）与p50近交系的雌性亲本（P2）杂交，组配F1代群体；F1代雌性个体与雄性亲本（P1）回交，同时进行蛾区内自交分别组配BC1F群体及F2代群体。使用P1、P2和F1筛选了28个连锁群上具有多态性的SSR分子标记，并使用BC1F群体确定了l-em基因位于家蚕第十连锁群；进一步对2287个F2代群体中产死卵的雌性个体检测，使用13个与l-em基因连锁的具有多态性的SSR标记，将l-em基因定位于S65与S82两个标记之间，相距约360kb，绘制出l-em基因的分子标记遗传连锁图谱；通过与家蚕基因组比对查明该区域内包含24个基因。二、候选基因的表达模式、基因结构分析和功能验证通过对24个基因在正常蛾及l-em卵突变体蛾卵巢内的表达分析，明确了2个差异表达基因BmVMP23和BmEP80为候选基因。BmVMP23基因的表达量在l-em卵突变体的卵巢中出现明显下调，而在l-em卵突变体的卵巢中则未检测到BmEP80基因的表达。反向PCR分析测序显示BmVMP23基因终止密码子后的第22个碱基至BmEP80基因ORF的第161个碱基间发生了突变，导致BmVMP23基因的3′-UTR和BmEP80基因结构的不完整性。对2个候选基因的RNAi试验表明，经BmEP80基因干扰后的部分雌蛾所产卵发生明显的凹陷，且表型与l-em卵突变体所产卵的表型相似，而对BmVMP23基因干扰未见此现象。因而推断BmEP80基因的突变是导致l-em卵突变体产生的主要原因。三、l-em突变体卵巢组织差异蛋白质分析通过双向电泳技术对正常个体及l-em卵突变体的卵巢组织进行蛋白质组学分析，结果显示BmEP80基因所编码的BmEP80蛋白从蛹期第九天开始在正常个体卵巢中大量表达，而在l-em卵突变体的卵巢中则未检测到该蛋白的表达。除了BmEP80蛋白之外的其他蛋白在正常个体和l-em卵突变体之间无明显差异。进一步说明了BmEP80蛋白的缺失是l-em卵突变体产生的主要原因。四、候选基因BmVMP23的表达调控分析鉴于l-em卵突变体的BmVMP23基因的3′-UTR结构被破坏，而3′-UTR为miRNAs的调控位点，为了分析miRNA对BmVMP23基因的表达调控作用，将BmVMP23基因的3′-UTR序列与家蚕的miRNAs序列比对，发现了一个与BmVMP23基因的3′-UTR序列匹配度极高的miRNA（bmo-miR-1a-3p）。荧光实时定量检测该miRNA在正常个体卵巢中表达量较高，且其表达趋势与BmVMP23基因的表达趋势相反，而在l-em卵突变体卵巢中仅有微量表达。通过miRNAmimic过表达和miRNA inhibitor抑制表达体外转染实验证实了bmo-miR-1a-3p能够抑制BmVMP23基因的表达。上述研究证实了卵黄膜蛋白BmEP80基因的突变是导致l-em卵突变体产生的主要原因，该研究为“明”死卵基因突变的分子机制的阐明提供了重要的理论依据，具有重要的科学意义和价值。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
英文缩写  11-18
第一章绪论  18-34
  1.1 家蚕突变基因的研究进展  18-20
    1.1.1 突变基因在家蚕优良品种选育方面的应用  18
    1.1.2 突变基因在家蚕新产品开发方面的应用  18-19
    1.1.3 突变基因在基因功能研究方面的应用  19
    1.1.4 突变基因在生物防治方面的应用  19
    1.1.5 突变基因在疾病研究中的应用  19-20
  1.2 遗传标记在突变基因检测中的应用  20-27
    1.2.1 形态学标记  20
    1.2.2 细胞学标记  20
    1.2.3 生物化学标记  20-21
    1.2.4 免疫学标记  21
    1.2.5 分子标记  21-27
  1.3 RNA 干涉技术在突变基因验证中的应用  27-32
    1.3.1 RNA 干涉技术简介  27-31
    1.3.2 RNAi 的应用  31-32
  1.4 研究目的和意义  32-33
  1.5 本研究的主要内容及方法  33-34
第二章家蚕“明”死卵突变体 l-e~m基因的连锁及定位分析  34-46
  2.1 引言  34
  2.2 材料与方法  34-39
    2.2.1 实验材料  34-35
    2.2.2 实验主要试剂和仪器  35-36
    2.2.3 实验方法  36-39
  2.3 实验结果  39-45
    2.3.1 实验材料发育情况  39
    2.3.2 BC1F 及 F2代的个体的表现型与基因型  39-41
    2.3.3 l-e~m基因所在连锁群的确定  41-42
    2.3.4 家蚕 l-e~m基因的初步定位  42-43
    2.3.5 与家蚕 l-e~m基因连锁的新的 SSR 标记  43
    2.3.6 F2代个体的基因型分析及 l-e~m基因的遗传连锁图  43-45
  2.4 讨论  45-46
第三章 l-em候选基因的鉴定  46-61
  3.1 引言  46
  3.2 材料与方法  46-52
    3.2.1 实验材料  46
    3.2.2 实验主要试剂和仪器  46-47
    3.2.3 实验方法  47-52
  3.3 实验结果  52-59
    3.3.1 筛选候选基因  52-54
    3.3.2 突变位点的确定  54-56
    3.3.3 候选基因在蛹期的表达变化  56-58
    3.3.4 RNAi 验证候选基因的功能  58-59
  3.4 讨论  59-61
第四章野生型和 l-e~m卵突变体卵巢蛋白质组学分析  61-72
  4.1 前言  61
  4.2 材料与方法  61-67
    4.2.1 实验材料准备  61
    4.2.2 实验仪器与试剂  61-64
    4.2.3 实验方法  64-67
  4.3 结果与分析  67-71
    4.3.1 正常卵与突变体卵的卵蛋白电泳图谱分析  67-68
    4.3.2 差异蛋白点的质谱鉴定  68-71
  4.4 讨论  71-72
第五章 MiRNAs 对 BmVMP23 基因表达的影响  72-92
  5.1 引言  72
  5.2 材料与方法  72-83
    5.2.1 实验材料  72-73
    5.2.2 实验主要试剂和仪器  73
    5.2.3 实验方法  73-83
  5.3 结果与分析  83-90
    5.3.1 家蚕 BmVMP23 基因全长 cDNA 的克隆  83-84
    5.3.2 BmVMP23 基因 3′-UTR 序列的结构分析  84-86
    5.3.3 与 BmVMP23 基因 3′-UTR 匹配的 miRNAs  86
    5.3.4 每个 miRNA 的组织表达分析  86-88
    5.3.5 Bmo-miR-1a-3p 对 BmVMP23 基因的 3′-UTR 的作用  88-90
  5.4 讨论  90-92
结论  92-94
参考文献  94-106
攻读学位期间发表的学术论文  106-108
致谢  108-110
详细摘要  110-118

家蚕“明”死卵突变体l-e~m基因的定位克隆及功能研究

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