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JAK/STAT途径对BmNPV的感染应答及家蚕作为痛风药物筛选动物模型的研究

作　者: 张晓丽
导　师: 贡成良
学　校: 苏州大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: JAK/STAT途径 BmNPV 转化细胞痛风药物筛选家蚕
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

JAK-STAT途径在果蝇中,调节多个发育进程,例干细胞的维持、眼的发育、胚胎分节配对规则基因(pair-rule genes)的表达。已发现昆虫在应答细菌和病毒感染时,JAK-STAT途径被激活,通过调节血球的分化和增殖,参与细胞免疫应答。家蚕在作为研究痛风药物的动物模型方面有许低成本、无生物危害及与伦理道德不冲突等诸多优点,更为重要的是家蚕体内尿酸代谢途径与人体内机制相同。为了探究家蚕JAK-STAT途径在病毒感染应答方面的作用及家蚕作为痛风药物筛选动物的可行性,我们主要开展了一下两方面的工作。1. JAK/STAT途径对BmNPV的感染应答JAK-STAT途径在哺乳类免疫应答中起中心作用,其活性丧失导致B-细胞和T-细胞功能缺陷,引起严重的免疫缺陷。昆虫的JAK-STAT信号途径在果蝇中首先被发现,STAT基因在果蝇以及草地夜蛾Sf9细胞中都存在长型和短型两种剪接体。在前期的研究中已克隆了开放读码框(ORF)的为2202nt的一种Bm-STAT的cDNA(命名为短型BmSTAT,BmSTAT-S),在电子克隆的基础上,通过RT-PCR成功克隆了BmSTAT的另一剪接型(命名为长型BmSTAT,BmSTAT-L),证明BmSTAT基因的确存在选择性拼接。测序结果显示Bm-STAT-L的ORF为2313 nt,编码770aa;通过对已有的基因组序列拼接和Gap填补,获得了BmSTAT的ORF所对应的基因组序列(28777bp),内含子、外显子分析显示,BmSTAT有20个外显子,BmSTAT-S由1-19外显子拼接而成,BmSTAT-L由1-18外显子和20外显子拼接而成。除了第11个内含子边界是GC-AG外,其它内含子的边界遵循GT-AG原则。为了进一步探讨家蚕JAK-STAT途径抗病毒感染的免疫应答,我们通过非转座子介导将家蚕信号转导子及转录激活因子(STAT)基因表达盒(BmSTAT)导入家蚕BmN培养细胞,经抗生素Zeocin筛选获得过表达BmSTAT的稳定转化细胞。线性化病毒Bm-BacPAK6感染结果显示:病毒感染后转化BmN细胞和正常BmN细胞的BmSTAT基因表达水平分别提高了32.70%和14.63%,表明家蚕JAK-STAT途径对杆状病毒感染有应答。比较转化BmN细胞和正常BmN细胞对杆状病毒感染的抵抗性,发现转化BmN细胞的病毒感染细胞比例低于正常BmN细胞,二者之间的感染率相差8.28%～18.02%;在感染病毒的转化细胞中,β-半乳糖苷酶基因的表达水平比病毒感染正常细胞的略低,推测这与转化细胞中BmSTAT的水平(JAK-STAT途径信号)高于正常细胞有关。然而,在BmN培养细胞中,BmSTAT基因的过表达尚不足以明显提高培养细胞的抗病毒感染。研究结果为进一步探讨家蚕JAK-STAT途径在病毒感染应答方面的作用奠定了基础。此外,为了进一步探讨过表STAT对家蚕的影响,我们将转基因载体pIZT-STAT通过精子介导法导入蚕卵,蚕卵孵化后正常饲养。通过GFP筛选在G0代获得呈绿色荧光的家蚕,用gfp特异性引物可以从荧光蚕的基因组中扩增出0.7kb的特异性条带,初步结果显示所获得的荧光蚕为转基因家蚕。2.家蚕作为痛风药物筛选动物模型痛风是由于尿酸单钠结晶在关节处堆积造成的一种疾病。血淋巴中尿酸含量过高通常能够导致痛风性关节炎、结节瘤的形成、高尿酸症、尿酸肾结石及肾脏疾病等疾病的发生。在过去的几十年中,人们一直利用小鼠作为哺乳动物模型来筛治疗高尿酸及痛风的药物,然而,作为痛风药物筛选的模式动物,小鼠存在一系列的问题:高成本,生物危害,伦理冲突等,最为重要的是小鼠体内的尿酸代谢机制与人体不同。因此迫切期望找到另外一种替代动物作为筛选和评估痛风药物的动物模型。在本研究中,我们以家蚕作为动物模型对痛风药物在降低家蚕体内尿酸含量及抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)方面的效果进行了评估。结果表明,通过口服给药的方式,对人类痛风病有治疗效果的药物在家蚕体内也能够同样发挥其作用。与对照组家蚕相比,别嘌醇能够有效降低治疗组家蚕体内的XOD活力,且有剂量依存性。与此相反,小苏打则没有降低XOD活力的作用。在连续给药(25 mg/ml/d别嘌醇或25 mg/ml/d小苏打)6天之后,口服别嘌醇的治疗组家蚕血淋巴和脂肪体内的尿酸含量降低约90%- 95%(P<0.01),口服小苏打的治疗组家蚕血淋巴和脂肪体内的尿酸含量降低约81%- 95%(P<0.01)。并且,与对照组相比,两种治疗组中的家蚕表皮都变得较为透明。因此,我们认为家蚕可以作为小鼠的替代动物用于治疗痛风的药物筛选。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstracts  7-12
引言  12-14
第一章 JAK-STAT 途径对昆虫先天性免疫的影响  14-21
  参考文献  18-21
第二章家蚕替代小鼠用于药物的筛选与评价  21-29
  参考文献  25-29
第三章研究目的与研究内容  29-32
  1 研究的目的和意义  29-30
  2 研究的主要内容  30-31
  3 技术路线  31-32
第四章实验材料与方法  32-46
  1 实验材料  32-37
  2 常用仪器  37-38
  3 试验常用方法  38-45
  参考文献  45-46
第五章家蚕长型stat 基因cDNA 的克隆与序列分析  46-54
  1 材料与方法  47
  2 结果与分析  47-51
  3 讨论  51-52
  参考文献  52-54
第六章 JAK/STAT 途径对家蚕杆状病毒感染应答初探  54-64
  1 材料与方法  56-57
  2 结果  57-59
  3 讨论  59-61
  参考文献  61-64
第七章过表达STAT转基因家蚕的构建与鉴定  64-70
  1. 材料与方法  65-66
  2. 结果与分析  66-67
  3 讨论  67-68
  参考文献  68-70
第八章利用家蚕作为模式动物筛选治疗痛风的药物  70-79
  1 材料和方法  71-72
  2 结果  72-76
  3 讨论  76
  参考文献  76-79
结论  79-80
  1 已取得的成果  79
  2 有待进行的研究  79-80
附录  80-84
  1 缩略词中英文对照表  80-82
  2 实验中使用的部分载体结构图  82-83
  3 攻硕期间科研情况  83-84
致谢  84-85

JAK/STAT途径对BmNPV的感染应答及家蚕作为痛风药物筛选动物模型的研究

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