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青贮用优良乳酸菌的分离筛选及其初步应用效果

作　者: 何轶群
导　师: 吴润
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 乳酸菌分离鉴定筛选生物学特性青贮有氧暴露
分类号: S816.53
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

【目的】为研究乳酸菌对青贮饲料的发酵品质和有氧稳定的影响，本试验从青贮饲料中分离和筛选出优良的乳酸菌菌种，将其制成菌制剂加入到全株玉米中，测定青贮及有氧暴露后样品营养成分和有氧稳定性。为开发新的菌制剂产品以及生产中合理选用菌制剂提供理论指导，为青贮发酵进程和青贮料有氧稳定性的研究提供科学依据。【方法】（1）采用平板分离法从青贮饲料等样品中分离乳酸菌，通过细菌形态学、生理生化特征和16SrRNA基因序列分析相结合的方法进行鉴定。利用产酸、抑菌、产纤维素酶试验从分离株中初步筛选具有青贮潜能的乳酸菌菌株，经生长曲线、温度敏感性、耐酸性、耐盐性等试验比较选定乳酸菌的生物学特性和抗逆性，确定青贮优良乳酸菌菌株。（2）将青贮优良乳酸菌菌株制成单菌制剂或组合菌制剂添加到玉米秸秆中，装入聚乙烯包装袋中抽气密封青贮。分别在青贮过程中的第3、7、15、30d，以及青贮后开袋的第1、3、7、15、30d取样，采用涂布平板法对样品中的细菌总数、乳酸菌总数、酵母总数、真菌总数进行统计计数，探究青贮和有氧暴露过程中的微生物变化动态。同时进行各样品pH及DM、NDF、ADF、CP、WSC、NH3-N、LA、AA、PA、BA含量测定，揭示各阶段微生物动态变化与各营养成分的相关性，最终选出适合玉米秸秆青贮的最佳菌制剂。【结果】（1）在GenBank中进行乳酸菌各分离株16S rRNA基因序列的BLAST分析，与相应参考菌株的同源性均达到99%以上。（2）产酸性以菌株B2-8产酸最快，B3-1、B1-6、B1-3、B2-9、B4-5次之，菌株B1-7、B2-3、B2-7、B5-1、B5-2、B6-1、B7-1、B7-10、E2-3产酸相对较慢，但20h后亦能降到pH4以下，均显示有较好的产酸特性。各分离株上清液对供试霉菌均无抑制作用；对细菌的抑制作用，菌株B3-1抑菌谱宽、抑菌活性最佳，菌株B2-3和B2-8次之，菌株B1-6、B1-7、B2-7、B5-1、B5-2仅对金黄色葡萄球菌有抑制作用。各分离菌株均不产纤维素酶。（3）青贮过程中，各组乳酸菌数量均在第7d时达到最大，之后逐渐减少，青贮期各试验组乳酸菌数量均显著高于对照组（P＜0.05）。酵母菌、霉菌数量在青贮初期快速增长，第3d达到最大，随后减少，分别于第15d、7d降到100CFU/g以下；有氧暴露后，各组乳酸菌数量持续减少，以对照组乳酸菌数量减少显著高于各试验组（P＜0.05）。各组酵母菌、霉菌数量逐渐增多，以对照组腐败微生物数量显著高于各试验组（P＜0.05）。（4）在青贮期和有氧暴露期各试验组的pH、WSC、NH3-N均显著低于对照组（P＜0.05），各试验组DM、CP、NDF、ADF、LA、AA含量显著高于对照组（P＜0.05），未检出PA、BA。【结论】（1）成功分离出32株乳酸菌，其中杆菌21株、球菌11株，经鉴定植物乳杆菌4株、发酵乳杆菌17株、屎肠球菌5株、肠系膜明串珠菌肠膜亚种1株、戊糖片球菌5株。（2）菌株B1-6、B1-7、B2-3、B2-8、B3-1、B5-2、B7-10、E2-3显示了较好的产酸能力和抑菌能力，具有良好的青贮潜力。通过生物学特性测定，最终选出菌株B1-7、B2-3、B3-1、B5-2、E2-3做实验室青贮。（3）全部乳酸菌组、同型乳酸菌混合组、植物乳杆菌B3-1组在提高青贮饲料发酵品质和有氧稳定性方面具有优势。

全文目录

摘要  3-4
Summary  4-6
目录  6-9
缩略词英汉对照表  9-10
第一章绪论  10-16
  1 乳酸菌及青贮饲料国内外研究进展  10-15
    1.1 青贮饲料发酵过程  10-11
    1.2 微生物对青贮发酵的影响  11-13
      1.2.1 乳酸菌对青贮饲料发酵的影响  11-12
      1.2.2 青贮发酵的优势同型发酵乳酸菌与异型发酵乳酸菌的研究  12
      1.2.3 梭菌对青贮饲料的影响  12
      1.2.4 腐败菌对青贮饲料的影响  12-13
      1.2.5 真菌对青贮饲料的影响  13
    1.3 乳酸菌对青贮饲料品质及有氧稳定性的研究  13
      1.3.1 乳酸菌对青贮饲料品质影响  13
      1.3.2 乳酸菌对青贮饲料二次发酵和有氧稳定性的影响  13
    1.4 青贮用纤维素分解工程乳酸菌研究进展  13-15
      1.4.1 降解纤维素酶的细菌和真菌  14
      1.4.2 乳酸菌表达系统研究进展  14
      1.4.3 乳酸菌表达系统存在问题  14-15
  2 研究目的和意义  15
  3 研究内容和方法  15-16
    3.1 青贮饲料优良乳酸菌的分离鉴定筛选及生物学特性研究  15
    3.2 乳酸菌对青贮及有氧暴露过程中微生物动态变化及青贮饲料品质的影响  15-16
第二章青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定筛选及其生物学特性研究  16-29
  1 材料与方法  16-18
    1.1 材料  16-17
      1.1.1 青贮样品  16
      1.1.2 菌株及主要试剂  16
      1.1.3 培养基  16
      1.1.4 仪器  16-17
    1.2 方法  17-18
      1.2.1 细菌分离  17
      1.2.2 乳酸菌分离株的鉴定  17
      1.2.3 优良乳酸菌的筛选  17-18
      1.2.4 乳酸菌生物学特性测定  18
  2 结果  18-26
    2.1 细菌分离  18
    2.2 乳酸菌分离株鉴定  18-22
      2.2.1 形态、染色及培养特性  18
      2.2.2 乳酸菌生理生化特性  18-22
      2.2.3 16S rRNA 基因序列特征  22
    2.3 优良乳酸菌的筛选  22-25
      2.3.1 产酸性试验  22-23
      2.3.2 产纤维素酶筛选试验  23
      2.3.3 抑菌试验  23-25
    2.4 优良乳酸菌生物学特性比较  25-26
      2.4.1 生长曲线测定  25
      2.4.2 不同温度生长试验  25-26
      2.4.3 耐盐性试验  26
      2.4.4 不同 pH 值生长试验  26
  3 讨论  26-29
第三章乳酸菌对全株玉米青贮过程及有氧暴露后的微生物动态变化与青贮品质的影响  29-42
  1 材料与方法  29-30
    1.1 材料  29
      1.1.1 菌种  29
      1.1.2 仪器与材料  29
      1.1.3 青贮样品及处理  29
    1.2 方法  29-30
      1.2.1 青贮饲料的制作及试验设计  29-30
      1.2.2 试验分组  30
    1.3 试验方法  30
      1.3.1 微生物计数及结果统计  30
      1.3.2 青贮饲料 pH 测定  30
      1.3.3 青贮饲料营养成分测定  30
      1.3.4 青贮饲料有机酸及 NH3-N 含量测定  30
    1.4 统计分析  30
  2 结果与分析  30-39
    2.1 青贮饲料中微生物动态变化  30-31
      2.1.1 乳酸菌变化  31
      2.1.2 细菌变化  31
      2.1.3 酵母菌变化  31
      2.1.4 霉菌变化  31
    2.2 青贮过程及有氧暴露后青贮饲料的 pH 和 NH3-N 变化  31-35
      2.2.1 pH 变化  31-34
      2.2.2 NH3-N 含量变化  34-35
    2.3 青贮过程及有氧暴露期样品营养成分变化  35-38
      2.3.1 青贮过程及有氧暴露后各阶段样品 DM 变化  35
      2.3.2 青贮过程及有氧暴露后各阶段样品 WSC 变化  35-36
      2.3.3 青贮过程及有氧暴露后各阶段样品 CP 变化  36-37
      2.3.4 青贮过程及有氧暴露后各阶段样品 NDF 变化  37
      2.3.5 青贮过程及有氧暴露后各阶段样品 ADF 变化  37-38
    2.4 青贮结束和有氧暴露结束后样品有机酸变化  38-39
  3 讨论  39-42
    3.1 青贮过程及有氧暴露期青贮饲料的微生物动态变化  39-40
    3.2 青贮过程及有氧暴露期青贮饲料的 pH 和有机酸变化  40
    3.3 青贮过程及有氧暴露期青贮饲料的营养成分变化  40-41
    3.4 乳酸菌对青贮饲料品质影响  41-42
结论  42-43
致谢  43-44
参考文献  44-49
作者简介  49-50
导师简介  50-51

青贮用优良乳酸菌的分离筛选及其初步应用效果

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