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枇杷授粉受精生物学研究与S基因克隆

作　者: 杨芩
导　师: 王永清
学　校: 四川农业大学
专　业: 果树学
关键词: 枇杷有效授粉期花粉管动力学自交不亲和性 S基因型克隆
分类号: S667.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究利用延迟授粉、组织化学检测和荧光显微观察方法首次确定了枇杷有效授粉期,并创新性地从柱头可授性、花粉活力、花粉原位萌发、花粉管生长动力学特性与胚囊寿命,以及降雨和温度对这些要素的影响方面系统地研究了枇杷授粉受精的内外影响因子,探明了枇杷有效授粉期决定因子对坐果率和果实种子数的影响。同时为了进一步阐明花粉管动力学特性,首次建立和优化了枇杷AS-PCR反应体系,并在此基础上首次确定了‘大五星’等18个品种或株系的S基因型,以及克隆和鉴定了枇杷的8个新S基因。主要研究结果如下：1.有效授粉期的确定延迟授粉、组织化学检测和荧光显微观察表明,‘大五星’和‘龙泉五号’品种与‘川农一号’株系的柱头可授性可以持续至花后5-6d,‘大五星’和‘龙泉五号’在开花当天柱头就具有较强的可授性,并在花后1-3d具有强的可授性,而‘川农一号’在开花当天只有部分柱头具有可授性,同时柱头具有强可授性的持续时间相对较短。2.花粉管动力学特性花粉管动力学特性研究表明,‘大五星’枇杷自花和异花授粉后花粉在柱头上的萌发率几乎无差异,授粉后2h花粉萌发率约为35%,授粉后8h花粉萌发率达到最大值；在授粉后第4h约有12%的花柱可以在其上部观察到花粉管,授粉后第12h可以在部分花柱的基部观察到花粉管。异花授粉后生长穿过花柱的花粉管量显著多于自花授粉。自花授粉后花粉管生长穿过上部、中部和基部的花柱比率差异显著,这表明花柱上部和中部是‘大五星’枇杷自交不亲性表现的主要部位。3.花龄对花粉萌发与花粉管生长的影响花龄对自花授粉和异花授粉后花粉萌发和花粉管生长的影响研究结果表明,大蕾期和花后46d进行授粉可以在一定程度上减轻花柱中的自交不亲和现象,蕾期与延迟自花授粉能够获得较高坐果率也佐证了这一结果。4.有效授粉期决定因子对坐果率和种子数的影响相关性分析结果表明,有效授粉期与柱头可授性、花粉管生长穿过的花柱比率及胚囊寿命密切相关,‘大五星’和‘龙泉五号’较高的坐果率和较多的果实平均种子数归因于其柱头具有较强可授性的时期较长,花粉管生长穿过的花柱和出现花粉管的胚珠比率均较高,而‘川农一号’较低的坐果率和较少的果实平均种子数归因于其柱头具有较强可授性的时期较短,花粉管生长穿过的花柱和出现花粉管的胚珠比率均较低。连续三年的实验结果表明,所试3份枇杷材料的有效授粉期是由遗传因子所决定,‘大五星’和‘龙泉五号’为依赖于柱头可授性的基因型,‘川农一号’为依赖于柱头可授性与胚珠退化的基因型。5.降雨对柱头可授性和花粉活力的影响以‘大五星’为试材,研究了阴雨天气对枇杷柱头可授性和花粉活力的影响。结果表明：持续的阴雨天气可以使枇杷柱头可授性和花粉活力不同程度的降低,降低授粉效率,对枇杷生产有负面影响。柱头可授性检测表明,‘大五星’枇杷柱头可授期为开花当天至花后第5d,在此期任何一天只要天气晴朗,柱头随即恢复并具有较强的可授性,这一特性可以一定程度地减少阴雨天气带来的负面影响。6.降雨对枇杷授粉受精的影响田间模拟降雨试验结果表明,萌发花粉粒和坐果率在授粉前4、2h与授粉前(-Oh)或后立即(Oh)模拟降雨的处理和对照间有显著差异,特别是模拟降雨后马上授粉与授粉后立即模拟降雨的两个处理与对照间的差异更明显。然而萌发花粉粒和坐果率在授粉前8h及授粉后2、4、8h和12h模拟降雨的处理与对照间差异不显著。室内模拟试验结果表明,保留在柱头上的萌发花粉粒数在所有的处理中都有所减少,特别是在授粉前后Omin或30min将枝条浸入水中的处理,以及枝条依次经过浸入水中、摇动、授粉、浸入水中与摇动的处理显著少于对照。这些结果表明,花粉与柱头乳突细胞的识别,及花粉的水合是十分迅速且有力的,除了在授粉前后立即降雨外,其他的处理均不能把柱头上的花粉冲洗掉。7.温度对枇杷柱头可授性和花粉活力的影响离体花枝在不同温度条件下培养不同时间后散粉情况观察、花粉活力与柱头可授性检测结果表明,5℃低温可以推迟枇杷花期和散粉时间,直至培养第7d花粉活力仍可以维持在55%左右的较高水平,同时柱头可授性在温度回升后也能维持和恢复在较强水平,同时有超过90%的胚珠具有活力。然而高温则促进花开放和加快散粉,同时加快花粉活力和柱头可授性的衰退,在30℃条件下培养至第7天花粉活力仅为6.39%,同时在培养第3d,柱头可授性已明显衰退,在第5d已不具可授性。这表明如果在枇杷气球花期遇持续的低温天气转晴后,气球花仍能顺利完成授粉过程,不会明显影响枇杷生产。8.温度对枇杷花粉萌发的影响通过对离体花枝在不同温度条件下培养,授粉后不同时间的花粉萌发情况的研究表明,在一定的温度范围内随温度的升高花粉的萌发时间逐渐缩短,萌发率逐渐提高,在5℃条件下花粉的萌发率仅约为10%,在10、15和20℃时萌发率显著提高至75%以上,但是温度升高至25和30℃时,萌发率又分别显著下降至约65%和45%。9.温度对枇杷花粉管生长的影响温度对花粉管生长的影响研究结果表明,花粉管在花柱中生长的跟踪观察结果与花粉萌发结果一致,在一定的温度范围内,花粉管生长速度随温度的升高逐渐加快,在10、15和20℃条件下被花粉管生长穿过的花柱比率和有花粉管的胚珠比率显著高于其他温度。当温度为5和30℃时,在授粉后120h均未发现有花粉管穿过花柱生长至胚珠。10.温度对枇杷胚囊寿命的影响温度对胚珠退化影响的结果分析表明,在5℃条件下培养120h后退化胚珠的比率仍仅为6%左右,而当温度升高至25和30℃时仅培养12h后退化胚珠比率均高达85%以上。这些结果表明,高温可以加速枇杷胚珠的退化,随温度的升高,胚珠退化的速率逐渐加快,同时退化胚珠的比率也逐渐增加,而适度的低温则有助于保持胚珠的活力,表明枇杷胚珠具有一定的耐寒能力。11.枇杷AS-PCR体系建立与优化以‘大五星’为试材,通过正交实验设计对影响枇杷AS-PCR反应较大的Mg2+等5个因素的浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化,运用正交设计直观分析法和DPS7.05统计软件对扩增结果进行方差分析。优化后的枇杷AS-PCR反应体系为：25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0mmol/L,Taq酶1.5U,引物0.5μmol/L,模板DNA80ng,dNTPs0.4mmol/L。反应程序为94℃预变性1mim,94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸1mim,35次循环,72℃延伸5mim,4℃保存。12.枇杷新S基因克隆与鉴定利用上述枇杷优化AS-PCR体系对‘大五星’等18个品种或株系的基因组DNA进行扩增,对获得的目的片段进行克隆测序及序列分析,共克隆12个基因,其中8个为枇杷的新S-RNases基因,分别命名为S11-RNase(ACCESSION:KC131137)、 S12-RNase(ACCESSION:KC131138)、S13-RNase(ACCESSION:KC131139)S15-RNase(ACCESSION:KC131135)、S16-RNase(ACCESSION:KC131136)、 S18-RNase(ACCESSION:KC131134)、S31-RNaae(ACCESSION:KC131133)和S41-RNase(ACCESSION:JX217035)。13.‘大五星’等18个枇杷品种(或株系)S基因型鉴定利用上述枇杷优化AS-PCR体系对‘大五星’等品种或株系的基因组DNA进行扩增,对获得的目的片段进行克隆测序及序列分析,确定了所试18个品种或株系的S-RNase基因型分别为：‘川农2号’S1-S41、‘黄密’S2-S5、‘贵妃’、‘有间’和‘早钟6号’S2-S6、‘香钟11号’S2-S15、‘龙泉5号’S2-S18、‘房光’S2-S31、‘冠玉’和‘大五星’S2-S41、‘早红’S5-S6、‘晚钟’、‘大白梨’和‘茂木’S6-S13、‘里间’S6-S15、‘软条白沙’S6-S31、‘川农1号’S11-S12和‘有永’S16-S41。14.枇杷S-RNase基因推导氨基酸序列同源性比较所克隆的12个枇杷S-RNase基因的推导氨基酸序列的同源性为53.3%—-97.8%,与蔷薇科梨属和苹果属S-RNase基因的同源性在48.6%—100%之间。其中枇杷S13-RNase基因与梨S3-RNase基因,及枇杷S2-RNase基因与梨S8-RNase基因的同源性都高达100%；枇杷S16-RNase基因与梨S1-RNase基因的同源性为96%；枇杷S18-RNase基因与苹果S1-RNase基因的同源性为93%；枇杷S16-RNase基因与苹果S6-RNase基因的同源性为93%。这些结果表明枇杷属、苹果属和梨属S-RNase基因在不同属间的同源性大于在同一属之内。此外,系统树构建结果表明,参试的33个S-RNase基因都是随机地分布在进化树的不同位置,并未形成属内的特异性群体。综合S-RNase同源性比较与系统树构建结果表明枇杷属植物的S-RNase在该物种分化前形成。

全文目录

目录  4-8
摘要  8-12
Abstract  12-18
缩写词  18-19
创新点  19-20
第一章果树有效授粉期及其影响因子研究进展  20-33
  摘要  20
  1 论文选题背景及理由  20-22
  2 有效授粉期研究进展  22-30
    2.1 有效授粉期的主要参数  23-26
      2.1.1 柱头可授性  23-24
      2.1.2 花粉管动力学  24-26
      2.1.3 胚珠活力和寿命  26
    2.2 有效授粉期的影响因子  26-30
      2.2.1 花器官败育与发育阶段  27
      2.2.2 树体营养水平  27-28
      2.2.3 化学物质  28
      2.2.4 温度和降雨  28-30
  3 枇杷有效授粉期需要阐明的几个主要问题  30-32
    3.1 枇杷有效授粉期关键决定因子  30
    3.2 枇杷主栽品种及重要育种材料的S基因型鉴定  30-31
    3.3 降雨和低温对枇杷授粉受精的影响  31-32
  4 选题的意义  32-33
第二章枇杷有效授粉期决定因子及其对坐果率和种子数的影响  33-52
  摘要  33-35
  1. 材料与方法  35-37
    1.1 材料  35
    1.2 方法  35-37
      1.2.1 有效授粉期的确定  35
      1.2.2 柱头可授性的组织化学检测  35
      1.2.3 花粉管动力学特性  35-36
      1.2.4 花龄对自花和异花授粉花粉原位萌发和花粉管生长的影响  36
      1.2.5 自然授粉条件下花粉管生长及胚囊寿命  36
      1.2.6 荧光显微压片观察方法  36-37
      1.2.7 数据分析  37
  2. 结果与分析  37-50
    2.1 有效授粉期的确定及其对坐果率和种子数的影响  37-41
    2.2 花粉管动力学特性  41-43
    2.3 花龄对自花和异花授粉花粉原位萌发和花粉管生长的影响  43-47
    2.4 自然授粉条件下花粉管生长及胚囊活力  47-50
  3 讨论  50-52
第三章降雨和温度对枇杷有效授粉期的影响及其寓意  52-79
  摘要  52-54
  1 材料与方法  54-57
    1.1 材料  54
    1.2 方法  54-57
      1.2.1 阴雨对花粉活力的影响  54
      1.2.2 降雨对柱头可授性的影响  54-55
      1.2.3 田间模拟降雨试验  55
      1.2.4 室内模拟降雨试验  55
      1.2.5 温度对花药散粉和花粉活力的影响  55-56
      1.2.6 温度对柱头可授性的影响  56
      1.2.7 温度对花粉原位萌发、花粉管生长和胚囊寿命的影响  56
      1.2.8 数据分析  56-57
  2 结果与分析  57-74
    2.1 阴雨对花粉活力及花粉密度的影响  57-59
    2.2 降雨对柱头可受性与黏液分泌的影响  59
    2.3 降雨对授粉受精的影响  59-62
    2.4 温度对枇杷花药散粉和花粉活力的影响  62-64
    2.5 温度对枇杷柱头可授性的影响  64-66
    2.6 温度对枇杷花粉原位萌发的影响  66
    2.7 温度对枇杷花粉管生长的影响  66-67
    2.8 温度对枇杷胚囊寿命的影响  67-74
  3 讨论  74-79
    3.1 阴雨对枇杷柱头可授性和花粉活力的影响  74
    3.2 降雨对枇杷授粉受精的影响  74-75
    3.3 温度对枇杷柱头可授性的影响  75-76
    3.4 温度对枇杷花粉萌发、花粉管生长及胚囊寿命的影响  76-77
    3.5 温度对枇杷有效授粉期决定因子影响的寓意  77-79
第四章 ‘大五星’等品种S基因型鉴定及新S-RNase基因克隆  79-111
  摘要  79-82
  1 材料与方法  82-85
    1.1 材料  82
    1.2 方法  82-85
      1.2.1 基因组DNA提取  82
      1.2.2 引物来源  82-83
      1.2.3 PCR扩增和优化设计  83-85
      1.2.4 电泳结果评分及差异分析  85
      1.2.5 S-RNase基因克隆与序列分析  85
  2 结果与分析  85-108
    2.1 枇杷AS-PCR体系建立与优化  85-92
      2.1.1 正交设计试验结果的直观分析评分及差异分析  85-87
      2.1.2. 各因素对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响  87-90
        2.1.2.1 Mg~(2+)浓度对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响  87
        2.1.2.2 Taq酶浓度对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响  87-88
        2.1.2.3 引物浓度对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响  88-89
        2.1.2.4 模板浓度对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响  89
        2.1.2.5 dNTPs对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响  89-90
      2.1.3 退火温度对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响  90-91
      2.1.4 退火时间对枇杷属植物AS-PCR反应的影响  91
      2.1.5 循环次数对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响  91-92
    2.2 S基因型鉴定  92-97
    2.3 新S-RN ase基因的鉴定及核苷酸序列比较  97-103
      2.3.1 ‘川农2号’等768bp序列鉴定  97-98
      2.3.2 ‘香钟’和‘里间’的313bp序列鉴定  98
      2.3.3 ‘龙泉5号’的325bp序列鉴定  98-99
      2.3.4 ‘房光’等的754bp序列鉴定  99-100
      2.3.5 ‘晚钟’等的666bp序列鉴定  100
      2.3.6 ‘川农1号’等的604bp和616bp序列鉴定  100-102
      2.3.7 ‘有永’等的594bp序列鉴定  102-103
    2.4 枇杷S-RNase基因序列同源性分析  103-105
    2.5 枇杷S-RNase基因序列和结构分析  105-107
    2.6 枇杷S-RNase基因系统进化树的构建  107-108
  3 讨论  108-111
    3.1 枇杷AS-PCR体系建立和优化  108-109
    3.2 ‘大五星’等18个品种的S基因型  109
    3.3 枇杷S基因的结构  109-111
第五章结论  111-113
参考文献  113-124
致谢  124-125
攻读博士学位期间发表的论文与获得的科研成果  125-126

枇杷授粉受精生物学研究与S基因克隆

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