学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

NtNAC-R1介导烟株打顶诱导烟碱生物合成过程

作　者: 程广伟
导　师: 刘卫群
学　校: 河南农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 烟草打顶根系 PMT NtNAC-R1 瞬时表达 RNAi
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 8次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

根系是烟碱的合成部位。烟株打顶后，烟草根系烟碱合成能力增强，已是不争之实。然而烟株打顶所导致烟叶中烟碱含量升高及调节机制并不清楚。为研究烟碱生物合成的分子调控机制，本实验室构建了烟株打顶前、后根尖组织的SSH-cDNA文库，从中筛选出一些相关基因的EST序列。本论文是以SSH-cDNA文库中筛选并克隆得到NtNAC-R1基因为研究对象，对该基因进行了内含子鉴定和亚细胞定位和瞬时表达分析；并进行遗传转化分析其在激素信号传导及烟碱生物合成中的调控作用。主要实验结果如下：（1）验证了NtNAC-R1基因与烟碱合成关键酶基因PMT之间的关系：与不打顶烟株相比，打顶24h根尖组织中的NtNAC-R1和PMT基因表达都上调，表明NtNAC-R1转录因子与烟株打顶刺激根系烟碱的生物合成相关。（2）以烟草基因组DNA为模板，克隆NtNAC-R1基因与以cDNA为模板克隆NtNAC-R1基因序列比对分析显示，该基因含有两个内含子，大小分别为613bp和97bp，具有典型的GU…AG内含子剪切特征，内含子区域富含AU，属于U2-型内含子。（3）对NtNAC-R1转录因子进行了亚细胞定位分析：构建了pS1300-NtNAC-R1-GFP融合表达载体，瞬时转化烟草叶片亚细胞定位检测证明该转录因子定位在细胞核。（4）分析了NtNAC-R1基因对JA和IAA信号途径的响应：建立瞬时表达分析体系，RT-PCR检测结果显示NtNAC-R1基因过表达，PMT表达量升高，JA信号途径标志基因PDF1.2和IAA信号途径标志基因IAA13表达量都降低；构建了NtNAC-R1基因的RNAi载体IR-NAC-RI，在IL-60BS病毒质粒的辅助介导下注射烟草叶片，RT-PCR分析PMT、PDF1.2、IAA13的表达模式表明PMT基因表达量下降，PDF1.2、IAA13表达量升高。以上实验结果表明，烟草NtNAC-R1转录因子受JA信号和IAA信号途径的交互对话影响，进而调控烟碱的生物合成。

全文目录

致谢  4-7
摘要  7-8
1 文献综述  8-14
  1.1 转录因子概况  8
  1.2 NAC 转录因子简介  8-9
  1.3 NAC 转录因子的生物调控作用  9-10
    1.3.1 转录调控  9
    1.3.2 转录后调控  9-10
    1.3.3 翻译后调控  10
  1.4 NAC 转录因子对根系发育影响研究进展  10-11
  1.5 打顶对烟草根系发育及烟碱合成的影响  11-12
  1.6 植物转录因子功能分析的主要方法  12-14
    1.6.1 瞬时表达分析技术  12
    1.6.2 过表达的转基因分析  12-13
    1.6.3 基因沉默技术  13-14
2 引言  14-15
3 材料与方法  15-24
  3.1 材料、试剂与仪器  15
    3.1.1 植物材料  15
    3.1.2 菌株、载体与主要试剂  15
    3.1.3 主要仪器  15
  3.2 实验方法  15-24
    3.2.1 总 DNA、RNA 的提取及 mRNA 的反转录  15
    3.2.2 烟株打顶前、后 NtNAC-R1 和 PMT 的 RT-PCR 检测  15-16
    3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备  16
    3.2.4 NtRNA-R1 基因 ORF 的克隆  16
    3.2.5 克隆载体 pMD19-T-NtNAC-R1 的构建  16-17
      3.2.5.1 大肠杆菌转化  17
      3.2.5.2 大肠杆菌转化子的鉴定  17
    3.2.6 亚细胞定位及过表达载体的构建  17-18
    3.2.7 农杆菌介导转化烟草叶片及 pS1300-NtNAC-R1 的瞬时表达  18-19
    3.2.8 NtNAC-R1 基因亚细胞定位分析  19
    3.2.9 NtNAC-R1 基因瞬时表达分析  19
    3.2.10 NtRNA-R1 基因的聚类分析  19-20
    3.2.11 NtRNA-R1 基因 RANi 载体的构建  20-21
    3.2.12 病毒介导的 RNAi 及分析  21
    3.2.13 实时荧光定量 PCR 检测 Auxin 基因  21-22
    3.2.14 叶盘法转化烟草愈伤组织及鉴定  22-24
4 结果与分析  24-35
  4.1 烟株打顶前、后 NtNAC-R1 和 PMT 的表达水平分析  24-25
    4.1.1 总 RNA 质量检测  24
    4.1.2 NtNAC-R1 和 PMT 表达水平的 RT-PCR 检测  24-25
  4.2 烟草 NtNAC-R1 基因的内含子鉴定  25-26
  4.3 烟草 NtNAC-R1 基因序列比对和进化分析  26-27
  4.4 烟草 NtNAC-R1 对 PMT 及 IAA 和 JA 信号途径的影响  27-34
    4.4.1 Auxin 基因的相对表达量分析  27-28
    4.4.2 NtNAC-R1 载体构建  28-31
      4.4.2.1 pS1300-NtNAC-R1-GFP 载体构建  28-29
      4.4.2.2 IR-NtNAC-R1-RI 载体构建  29-31
    4.4.3 NtNAC-R1 对 PMT 及 IAA 和 JA 信号途径的影响  31-34
      4.4.3.1 NtNAC-R1 过表达后对 PMT、PDF1.2、IAA13 基因表达的影响  31-32
      4.4.3.2 NtNAC-R1 基因的遗传转化  32
      4.4.3.3 NtNAC-R1 沉默后对 PMT、PDF1.2、IAA13 基因表达的影响  32-34
  4.5 NtNAC-R1 基因亚细胞定位  34-35
5 结论与讨论  35-37
参考文献  37-41
ABSTRACT  41-42

NtNAC-R1介导烟株打顶诱导烟碱生物合成过程

内容摘要

全文目录

相似论文