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茶氨酸合成相关基因RNAi载体的构建及茶树遗传转化研究

作　者: 汤志近
导　师: 宛晓春
学　校: 安徽农业大学
专　业: 茶学
关键词: 茶氨酸合成相关基因GS1-1 “零背景克隆” 技术 RNAi 遗传转化 抗性愈伤
分类号: S571.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


茶氨酸为茶树特有的非蛋白质氨基酸，催化其合成的关键酶尚未研究清楚。RNAi是双链RNA的衍生复合物诱导同源基因mRNA降解的转录后基因沉默技术。在本实验室构建的茶树幼根cDNA文库中，获得GS1-1基因（contig47）的EST序列，通过实时荧光定量PCR技术验证该基因可能与茶氨酸合成相关。利用GS1-1基因的3-UTR及其邻近区域构建RNAi载体进行茶树叶片遗传转化，以期进一步解释茶氨酸生物合成机制。主要结论如下：1、茶氨酸合成相关基因GS1-1的RNAi载体构建。在本实验室获得茶氨酸合成相关基因GS1-1的EST序列的基础上，通过SMART RACE技术获得其3’-端全长序列。选取3-UTR及其邻近区一段长350bp序列为干涉的目的片段，再从载体pJawohl8上选取一段大小为500bp的内含子序列（茶基因组内无）为填充片段，运用“零背景克隆”技术构建出“发夹”结构，通过验证该结构正确。将其重组到植物表达载体pCAMBIA2301上，转化到农杆菌EHA105中，成功构建出RNAi载体pCAM-RNAi-GS。2、龙井-43叶片愈伤诱导最佳激素浓度及抗生素浓度筛选的研究。由于茶树再生困难，选取龙井43叶片作为遗传转化受体材料。叶片在1/4MS+TDZ0.1μmol·L-1+IBA0.49μmol·L-1+2,4-D0.005mg·L-1的培养基上培养60d后，愈伤组织诱导率最高达96%。将叶片置于含不同浓度卡那霉素的培养基上培养，获得龙井-43的卡那霉素抗性标记筛选浓度为100mg·L-1。3、根癌农杆菌介导转化龙井43叶片。以龙井43叶片为受体材料，预培养3d后用活化的农杆菌EHA105（含RNAi载体pCAM-RNAi-GS）侵染15min，置于YMB培养基中共培养4d，脱菌后置于筛选培养基上培养，获得8块抗性愈伤组织。经GUS组织化学染色和PCR检测验证其中3块（愈伤-4，愈伤-5，愈伤-6）为阳性结果。利用0.05%的三氟乙酸做流动相，高效液相色谱法（HPLC）测定抗性愈伤组织内茶氨酸含量，愈伤-4和愈伤-5茶氨酸含量与对照相比下降了85.09%。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-9
术语与缩略语表  9-10
1 文献综述  10-19
  1.1 RNA 干扰技术  10-15
    1.1.1 RNAi 的发现  10
    1.1.2 RNAi 的作用机制和原理  10-11
    1.1.3 RNAi 技术在植物生物学中的应用  11-13
    1.1.4 RNAi 载体构建的方法  13-15
  1.2 茶氨酸研究进展  15-17
    1.2.1 茶氨酸概述  15
    1.2.2 茶氨酸的生物合成研究进展  15
    1.2.3 合成茶氨酸相关酶研究进展  15-17
  1.3 茶树遗传转化研究进展  17-19
    1.3.1 影响茶树遗传转化的因素  17
    1.3.2 茶树遗传转化方法  17-19
2 引言  19-21
  2.1 研究目的及意义  19
  2.2 研究内容和技术路线  19-21
    2.2.1 研究内容  19-20
    2.2.2 技术路线  20-21
3 材料与方法  21-34
  3.1 试验材料  21
  3.2 仪器与试剂  21-22
    3.2.1 主要实验仪器  21
    3.2.2 主要试剂  21-22
    3.2.3 引物合成与测序  22
  3.3 试验方法  22-34
    3.3.1 茶氨酸合成相关基因（GS1-1）3’-端序列获得  22-25
    3.3.2 RNAi 载体的构建  25-31
    3.3.3 茶树叶片遗传转化研究  31-34
4 结果与分析  34-45
  4.1 茶氨酸合成相关基因的 3′-端序列获得  34-35
    4.1.1 总 RNA 提取与质量检测  34
    4.1.2 茶氨酸合成相关基因的 3′-端序列获得  34-35
  4.2 RNAi 载体的构建  35-39
    4.2.1 目的片段和填充片段扩增与验证  35-36
    4.2.2 “发夹”结构扩增与验证  36-38
    4.2.3 RNAi 载体的构建与验证  38-39
  4.3 “龙井 43”叶片的遗传转化  39-45
    4.3.1 诱导叶片愈伤最佳激素配方的确定  39-40
    4.3.2 卡那霉素筛选浓度的确定  40-41
    4.3.3 农杆菌介导遗传转化结果  41-45
5 讨论  45-48
  5.1 茶氨酸合成相关基因 GS1-1 的 RNAi 载体构建  45
  5.2 农杆菌介导茶树叶片遗传转化抗性愈伤的获得  45-46
  5.3 RNAi 在茶学研究的应用  46-48
6 结论  48-49
参考文献  49-55
附录  55-57
致谢  57-58
作者简介  58
在学期间发表的论著及科研成果  58

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 饮料作物 > 茶
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