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沉默膨胀素基因对乌拉尔甘草悬浮细胞的影响

作　者: 肖天剑
导　师: 李兴林
学　校: 天津科技大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: RNAi 膨胀素乌拉尔甘草悬浮细胞
分类号: S567.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本实验利用RNAi干涉技术,沉默乌拉尔甘草膨胀素基因,降低膨胀素含量,使悬浮培养的甘草细胞体积缩小,以达到细胞高密度培养的目的。以大豆膨胀素基因Exp2(Genbank AF516880)核苷酸序列为对象,通过与多个植物种膨胀素基因的核苷酸序列作比较,选定其两个保守区各50个碱基对左右的核苷酸序列为正向片段(Ⅰ和Ⅱ),并以其为依据,分别设置其对应的反向序列(Ⅰ’和Ⅱ’)；根据两对正、反序列设计出合适的引物,从而在PCR扩增过程中,使正反片段分别引入限制性内切酶位点(EcoR I和Hind III)和相应的3U-AG内含子端部序列。经过Ⅰ和Ⅱ’以及Ⅰ和Ⅱ’两组片段的两两连接和PCR筛选获得Ⅰ-Ⅱ’、Ⅱ-Ⅰ’两种连接片段；这两种片段在酶切、再连接、转化、克隆和鉴定后,得到了四片段的Ⅰ-Ⅱ’-Ⅱ-Ⅰ’序列产物；该产物插入到pCAMBIA2300植物表达载体,导入农杆菌感受态EHA105,筛选出能转化植物的工程菌。甘草幼苗的上胚轴在MS固体培养基中预培养2d,然后与农杆菌工程菌25℃共培养2d,随后在含50mg/L潮霉素的培养基中进行选择培养15d,筛选出抗性愈伤组织并进行继代培养；将松散的抗性愈伤组织置于MS液体培养基中,25℃、120r/min下进行悬浮培养,并对转化与非转化两种悬浮细胞的大小、形态和生长曲线进行比较。结果表明,1)按照设计要求,经过测序证明,获得了Ⅰ-intron Ⅱ’-Ⅱ-intron-Ⅰ’干涉DNA片段的重组,其转录的mRNA能够互补配对形成发卡结构,符合干涉RNA片段的构建要求；2)当悬浮培养的农杆菌浓度达到OD600为0.4时,25℃共培养2d,干燥处理后能大大提高抗性愈伤组织出愈率；3)转化后的愈伤组织生长速度缓慢；4)在光学显微镜下观察,转化悬浮细胞比非转化的悬浮细胞体积小；5)同对照材料比较,转化的悬浮细胞的生长周期长；6)同对照材料比较,转化的悬浮细胞膨胀素含量降低；7)提取悬浮细胞的DNA进行PCR分析,干涉的目的片段已经插入到甘草细胞基因组中。由此表明,在细胞内该序列转录的mRNA将形成双链RNA片段,它对膨胀素基因的转录产物mRNA产生了干涉作用,抑制了膨胀素的合成,影响细胞壁纤维素与半纤维素的非共价键断裂,至使细胞壁结构致密,细胞体积缩小。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-28
  1.1 植物细胞悬浮培养概述  9-11
    1.1.1 植物悬浮细胞培养应用  9-11
    1.1.2 植物悬浮培养中存在的问题  11
  1.2 膨胀素(expansin)  11-21
    1.2.1 膨胀素的发现  11-13
    1.2.2 膨胀素结构  13-14
    1.2.3 膨胀素功能  14-17
    1.2.4 膨胀素基因概述  17-18
    1.2.5 膨胀素基因调控机理  18-21
  1.3 甘草概述  21-23
    1.3.1 甘草的药理作用  21-23
  1.4 基因RNA干涉的应用  23-26
    1.4.1 RNA干涉在植物基因功能研究中的应用  23-24
    1.4.2 RNA干涉在植物抗病毒研究中的应用  24
    1.4.3 RNA干涉在作物品种改良中的应用  24-25
    1.4.4 RNA沉默在其他方面的应用  25-26
    1.4.5 RNA干涉DNA片段的构建概述  26
  1.5 本课题的研究目的、内容和意义  26-28
2 材料与方法  28-39
  2.1 实验材料  28-32
    2.1.1 菌种和乌拉尔甘草  28
    2.1.2 主要试剂  28-29
    2.1.3 实验仪器及设备  29-30
    2.1.4 溶液  30-31
    2.1.5 培养基  31-32
  2.2 实验方法  32-39
    2.2.1 抗生素敏感性试验  32-33
    2.2.2 膨胀素基因同源性比较  33-34
    2.2.3 DNA合成及引物设计  34
    2.2.4 质粒提取及酶切鉴定  34-35
    2.2.5 感受态细胞制备  35-36
    2.2.6 PCR扩增  36
    2.2.7 连接、转化  36-37
    2.2.8 CTAB法提取DNA  37
    2.2.9 膨胀素蛋白的提取  37
    2.2.10 转化体的获得  37-38
    2.2.11 转化体与非转化体比较  38-39
3 结果与讨论  39-61
  3.1 抗生素敏感性试验  39
  3.2 DNA片段及引物设计  39-40
  3.3 DNA干涉片段的构建与克隆  40-45
    3.3.1 构建思路与目标  40-41
    3.3.2 两片段连接及PCR筛选  41-42
    3.3.3 四片段DNA连接  42-43
    3.3.4 靶标序列与pUC19-T载体连接  43-45
  3.4 表达载体构建  45-48
    3.4.1 构建路线与目标  45-46
    3.4.2 靶标序列与Pcambia2300连接  46-48
  3.5 农杆菌转化及鉴定  48-50
    3.5.1 农杆菌转化  48-49
    3.5.2 EHA105鉴定  49-50
  3.6 转化体的获得  50-56
    3.6.1 外植体预培养  50-51
    3.6.2 共培养  51-52
    3.6.3 转化条件优化  52-54
    3.6.4 选择培养  54-56
  3.7 转化体与非转化体比较  56-61
    3.7.1 愈伤组织生长分析  56-57
    3.7.2 悬浮细胞生长曲线的绘制  57-58
    3.7.3 悬浮细胞观察  58-59
    3.7.4 膨胀素蛋白鉴定  59-60
    3.7.5 悬浮细胞PCR检测  60-61
4 结论  61-62
5 展望  62-63
6 参考文献  63-71
7 论文发表情况  71-72
8 致谢  72

沉默膨胀素基因对乌拉尔甘草悬浮细胞的影响

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