学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

水稻OsNPR1启动子中响应SA、ET的关键DNA区域分析

作　者: 涂雨辰
导　师: 田云
学　校: 湖南农业大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 启动子植物激素 OsNPR1 顺式作用元件
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 5次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

[目的]OsNPRl对于植物防御的功能研究有十分重要的意义,水稻(Oryza sative L.)基因组中NPRl的3个同源基因均受到白叶枯病菌、稻瘟病菌以及防卫相关物质苯并噻二唑、茉莉酮酸甲酯和乙烯的诱导,而NPR1又是水杨酸(SA)介导的抗病反应的关键调控因子,研究表明OsNPR1可能调控了水稻中水杨酸依赖通路的拮抗性交互调节,这都说明OsNPR1作为一个抗病基因能响应激素胁迫的应答,但是OsNPR1对SA以及ET诱导反应具体依赖的关键DNA区域还不清楚,因此,研究OsNPR1的启动子区并对其中的关键DNA区域进行分析,是阐明OsNPR1在水稻防御反应中的分子机制的重要途径之一。本研究运用生物信息学、分子生物学等多种方法对OsNPR1的启动子以及对激素的应答反应进行研究。[方法]在本研究中,为了鉴定基因受激素诱导起重要作用的调控元件及相关功能分析,对基因的启动子区进行克隆,构建出表达载体OsNPR1再利用农杆菌介导,将载体导入烟草(Nicotiana tabacum)叶片,进行瞬时表达实验,研究其表达特异性。使用激素MeJA、ET、SA、ABA、IAA、GA及高盐、低温、干旱等处理烟草苗。为了进一步确定基因启动子区的关键DNA区域,对启动子区序列进行缺失突变,再分别将缺失片段的启动子与GUS报告基因融合,对GUS活性进行检测,以此研究启动子的表达特性,有助于更深入了解该水稻抗病基因响应不同胁迫信号表达的分子机制。[结果]1、从水稻基因组中扩增出OsNPR1的启动子区,再进一步构建到带有GUS报告基因的启动子表达载体p1381Z上,得到表达载体POsNPRl:GUS,用激素MeJA、ET、SA、ABA、IAA、GA及高盐、低温、干旱处理后,GUS染色结果显示融合基因在烟草中的表达受SA和ET的诱导。2、为了验证SA以及ET应答元件所在位置,以OsNPR1启动子全长序列为基础,构建一系列5’启动子片段删除载体。突变的启动子与GUS构建的融合基因在烟草中受SA以及ET诱导的瞬时表达结果,说明该启动子中-700bp至-300bp这段序列可能是OsNPR1响应SA以及ET信号的关键区域,结合PLACE软件的预测,这一段序列当中存在着一个WBOXATNPR1(TTGAC,-485至-480,-501至-496)是响应SA的重要应答元件,同时T-box (ACTTTG,-648至-643)则是响应ET应答的关键元件。[结论与意义]通过构建缺失不同启动子片段的植物表达载体POsNPRl:GUS,具体确定了响应SA以及ET的关键DNA区域,从而为分离基因的启动子并鉴定其中可能负责应答不同逆境的区域或顺式作用元件的研究提供理论基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
1 前言  11-22
  1.1 启动子的概念及分类  11-13
  1.2 启动子顺式作用元件的研究方法  13-14
  1.3 与非生物胁迫相关的重要植物激素SA、ET  14-17
    1.3.1 水杨酸是植物体内具有重要调节作用的内源激素之一  14-16
    1.3.2 ET的生理功能与生物学功能  16
    1.3.3 烯在水稻中的生理效应与信号传导途径  16-17
  1.4 农杆菌瞬时表达技术及GUS基因的应用  17-19
  1.5 水稻NPR1研究情况  19-20
  1.6 研究目标与主要研究内容  20-22
    1.6.1 研究目的与意义  20-21
    1.6.2 技术路线  21-22
2 材料和方法  22-35
  2.1 实验材料  22-26
    2.1.1 植物材料  22
    2.1.2 供试菌株及供试质粒  22
    2.1.3 主要试剂  22
    2.1.4 试剂配制  22-26
  2.2 基本实验方法  26-31
    2.2.1 水稻基因组DNA提取  26
    2.2.2 质粒DNA的提取  26-27
    2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备  27-28
    2.2.4 大肠杆菌热激转化  28
    2.2.5 PCR扩增OsNPR1启动子  28-29
    2.2.6 OsNPR1与pMD18-T载体的连接  29
    2.2.7 大肠杆菌DH5a感受态细胞转化及转化子的筛选与鉴定  29-30
    2.2.8 构建载体  30-31
  2.3 农杆菌EHA105介导的烟草瞬时表达  31
  2.4 烟草NC89的培养  31-32
  2.5 农杆菌感受态细胞制备  32
  2.6 农杆菌的冻融法转化、检测、菌种保存  32-33
  2.7 农杆菌悬浮菌液的制备  33
  2.8 接种及激素处理  33-34
  2.9 GUS定性组织分析  34-35
3 结果与分析  35-48
  3.1 日本晴水稻总DNA的提取  35
  3.2 OsNPR1启动子的扩增与鉴定  35-37
    3.2.1 OsNPR1启动子的PCR扩增  35-36
    3.2.2 PCR产物的克隆  36-37
    3.2.3 OsNPR1启动子片段测序比对结果  37
  3.3 表达载体构建以及鉴定  37-40
    3.3.1 设计带酶切位点的引物  37
    3.3.2 PCR扩增OsNPR1带酶切位点的全长启动子  37-38
    3.3.3 PCR产物的克隆  38-39
    3.3.4 全长启动子表达载体的构建  39-40
  3.4 烟草中瞬时表达实验  40-42
  3.5 OsNPR1启动子应答SA、ET诱导的必需区域的鉴定  42-48
    3.5.1 OsNPR1启动子的缺失突变分析  42-43
    3.5.2 构建序列删除载体  43-45
    3.5.3 不同的表达载体在烟草中GUS报告基因的瞬时表达分析  45-48
4 讨论  48-50
5 结论、创新点及下一步工作计划  50-52
  5.1 结论  50
  5.2 创新点  50
  5.3 下一步工作计划  50-52
参考文献  52-57
附录1：Marker条带图谱  57-58
附录2：引物序列  58-59
致谢  59-60
作者简介  60

水稻OsNPR1启动子中响应SA、ET的关键DNA区域分析

内容摘要

全文目录

相似论文