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柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv.citri）琥珀酸脱氢酶B亚基原核表达及体外与拌种灵药物结合研究

作　者: 邢春杰
导　师: 陈长军
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 柑橘溃疡病菌琥珀酸脱氢酶B亚基原核表达纯化 DTNB-SH法拌种灵
分类号: S436.66
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

由Xanthomonas axonopodis pv. citri引起的柑橘溃疡病是热带和亚热带柑橘种植园中最危险的病害之一,是许多国家的检疫对象。在我国大部分柑橘产区发生、为害。由于缺少有效的抗该病的种质资源,化学防治仍然是控制该病的主要措施。拌种灵是一种丁烯酰胺类高效、广谱的内吸性杀菌剂,不仅可以防治由担子菌亚门真菌引起的植物病害,还对植物细菌性病害尤其是黄单胞菌具有较好的防治效果。本实验室的前期研究表明,柑橘溃疡病菌琥珀酸脱氢酶B亚基的点突变导致其对拌种灵的抗药性。本文以对拌种灵不同敏感性水平的柑橘溃疡病菌为研究对象,克隆琥珀酸脱氢酶B亚基的全序列,分别进行原核表达,将该蛋白与药剂进行体外结合,旨在为柑橘溃疡病菌对拌种灵抗药性分子机制提供直接证据。具体如下：载体构建和表达验证。分别扩增了柑橘溃疡病菌(X. axonopodis pv.citri)对拌种灵敏感菌株及抗性菌株中的琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)的基因全长,经测序后,将对拌种灵不同敏感性水平菌株的sdhB基因分别连接到表达载体pET30a (+)上,然后转化到大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株Rosseta (DE3) pLysS中,获得重组表达突变体。通过IPTG (1mM)37℃诱导表达6-8h得到了分子量为35kDa的目的蛋白。Western-blot验证结果表明,该蛋白能与抗His标签的单克隆抗体发生特异性反应,表明该蛋白是柑橘溃疡病菌琥珀酸脱氢酶B亚基基因所编码的蛋白质。原核表达条件的优化和纯化。在大肠杆菌中表达SdhB亚基,筛选使SdhB亚基蛋白可溶性表达的诱导因子,并对可溶性蛋白纯化条件进行优化。以已构建好的(pET30a+-sdhB)质粒为重组表达载体,转化到表达宿主菌Rossatta (DE3) pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达,并筛选蛋白可溶性表达的诱导因子；对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot验证。最终获得了在大肠杆菌中表达效率高的阳性克隆。为了克服常规诱导条件下表达的SdhB亚基主要以包涵体形式存在的问题,通过对诱导温度、时间和诱导物浓度等因子的综合分析,原核表达的优化条件为在20℃、0.6mM IPTG诱导12h后可溶性SdhB亚基的表达量最大；利用HisTrapHP预装柱纯化的优化条件为结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中咪唑浓度分别为20mM、75mM、300mM. SDS-PAGE分析表明表达出的融合蛋白分子量为35kD,且能与6xHis的单克隆抗体发生特异性反应。该研究为外源基因在大肠杆菌中的可溶性表达提供了参考；获得的SdhB亚基蛋白为研究以琥珀酸脱氢酶SdhB亚基为靶标类药物的抗性机制以及生产中开发新的以琥珀酸脱氢酶为靶标的杀菌剂提供了物质基础。原核表达的SdhB蛋白与拌种灵药物体外结合。采用DTNB-SH方法测定了柑橘溃疡病菌敏感与抗性菌株原核表达的琥珀酸脱氢酶B亚基与拌种灵体外结合程度。2.2μmo1·L-1拌种灵与不同抗性水平的柑橘溃疡病菌的SdhB亚基反应后,用10μmo1·L-1的DTNB与其游离的半胱氨酸残基中的巯基结合,结果表明X1、XA、XB、XC中每个SdhB亚基中半胱氨酸残基中游离巯基分别为4.62±0.33、6.88±0.43、10.60±1.00、12.26±0.45；由此推算出敏感菌株中的SdhB亚基与拌种灵结合程度为66.75%±2.39%,抗性菌株XA、XB、XC分别为50.84%±3.13%、24.29%±7.17%、12.44%±4.07%。该结果表明,药物和分子靶标的亲和性差异导致了菌株对药物的敏感性差异,为柑橘溃疡病菌SdhB亚基点突变导致菌体对拌种灵抗药性及SdhB是拌种灵的分子靶标提供了直接证据。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
符号及縮略词  11-12
上篇文献综述  12-42
  第一章柑橘溃疡病的发生及防治  13-23
    1 柑橘溃疡病的危害  13-14
    2 柑橘溃疡病菌的生物学描述  14-15
      2.1 柑橘溃疡病菌的发现及分类地位  14
      2.2 柑橘溃疡病菌微生物性状  14
      2.3 柑橘溃疡病菌的致病症状和传播方式  14-15
    3 柑橘溃疡病菌与寄主抗病性互作的关系  15-16
    4 柑橘溃疡病综合防治  16-19
      4.1 化学防治  16-17
      4.2 田间管理  17
      4.3 生物防治  17
      4.4 检疫防治  17
      4.5 选育抗病性品种  17-19
    参考文献  19-23
  第二章拌种灵杀菌剂研究现状  23-31
    1 羧基酰胺类杀菌剂简介  23-25
    2 拌种灵的基本性质  25
    3 拌种灵的应用  25-28
      3.1 拌种灵的抑菌谱  25-27
      3.2 拌种灵的田间应用  27
      3.3 拌种灵在细菌病害防治上的应用  27-28
    4 拌种灵研究现状  28-29
      4.1 拌种灵对柑橘溃疡病菌作用机理  28
      4.2 柑橘溃疡病菌对拌种灵抗药性  28-29
    参考文献  29-31
  第三章琥珀酸脱氢酶抑制剂类SDHIs杀菌剂的发展  31-42
    1 SDHIs类杀菌剂的作用机制  31-32
    2 SDHIs类杀菌剂的主要品种  32-34
    3 SDHIs类杀菌剂的抗性发生情况及抗性机制  34-38
      3.1 萎锈灵的抗性发生情况及相关抗性机制  35-36
      3.2 啶酰菌胺的抗性发生情况及其抗性机制  36-37
      3.3 其他  37-38
    4 SDHIs类杀菌剂抗性风险管理建议  38-39
    参考文献  39-42
下篇研究内容  42-75
  第一章柑橘溃疡病菌对拌种灵不同敏感性水平菌株SdhB亚基的原核表达载体构建和表达  43-53
    摘要  43-44
    1 材料与方法  44-46
      1.1 材料  44
      1.2 方法  44-46
    2 结果与分析  46-50
      2.1 柑橘溃疡病菌抗性菌株含药转接后的EC_(50)  46
      2.2 柑橘溃疡病菌SdhB基因PCR扩增结果  46-48
      2.3 克隆质粒的酶切验证和序列分析  48
      2.4 重组表达质粒鉴定  48
      2.5 融合蛋白表达效率及可溶性分析  48-49
      2.6 SdhB亚基的Western-blot检测  49-50
    3 讨论  50-51
    参考文献  51-52
    ABSTRACT  52-53
  第二章 SdhB基在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化研究  53-65
    摘要  53-54
    1 材料与方法  54-56
      1.1 材料及主要试剂  54
      1.2 方法  54-56
    2 结果与分析  56-61
      2.2 SdhB亚基可溶性表达条件优化  56-59
      2.3 可溶性SdhB基的纯化  59-61
    3 结果与讨论  61-63
    参考文献  63-64
    ABSTRACT  64-65
  第三章琥珀酸脱氢酶B亚基与拌种灵体外结合研究  65-75
    摘要  65
    1 材料与方法  65-67
      1.1 材料  65-66
      1.2 方法  66-67
    2 结果与分析  67-71
      2.1 DTNB-SH法检测SdhB亚基中半胱氨酸残基中的SH  67-69
      2.2 不同敏感水平菌株SdhB亚基的原核表达蛋白与拌种灵的结合率测定  69-70
      2.3 柑橘溃疡病菌SdhB亚基核苷酸序列构建系统进化树  70-71
    3 讨论  71-72
    参考文献  72-73
    ABSTRACT  73-75
全文小结  75-77
  一、本研究获得的主要结果  75
  二、本文创新点  75
  三、尚待认识和解决的问题  75-77
发表论文  77-79
致谢  79

柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv.citri）琥珀酸脱氢酶B亚基原核表达及体外与拌种灵药物结合研究

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