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球孢白僵菌萌发和毒力标记物及外源基因对其代谢组影响

作　者: 罗飞飞
导　师: 胡丰林
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: B.bassiana 液质联用代谢组学工程菌株萌发毒力
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究用基于HPLC-MS的代谢组学方法研究了球孢白僵菌(Beauveriabassiana)转aaIT基因的工程菌株与野生型菌株的代谢物差异，以期了解外源基因对代谢的干扰。并且用同样的方法识别了球孢白僵菌的萌发和毒力标记物，这将有助于提高B. bassiana菌株的筛选速率和产品质量控制。1外源基因对球孢白僵菌的代谢影响B. bassiana被广泛用于防止各种害虫，但致死率低和对环境敏感使它的应用受到限制。采用生物工程技术将蝎毒素基因aaIT转入野生B. bassiana菌株能显著提高其毒力，但这种外源基因对B. bassiana的代谢影响目前并不为人所知。为此，我们首次应用高分辨液质联用并结合多变量统计分析的代谢组学方法对B. bassiana工程菌株与野生菌株的菌丝和孢子代谢轮廓进行了分析。PCA和OPLS-DA的分析结果显示，工程菌株和野生菌株的菌丝和孢子代谢物都存在显著差异，表明外源基因插入强烈影响了B. bassiana的代谢。聚类分析结果进一步证实了工程菌株与野生菌株的代谢具有显著差异。差异代谢物包括ergothioneine、glyoxylate、pyruvic acid、fumarate、betaine, carnitine、acetylcarnitine、fatty acids、 glycerophospholipids、 trehalose、 beauverolides、 glutamic acid、sphinganine、dimethyl guanosine等，其中最为显著的是脂肪酸和磷酯类代谢物普遍减少。代谢途径分析发现上述菌丝中大部分成分变化与氧化胁迫及能量代谢有关，如：转基因菌丝中，甘油磷脂、脂肪酸的减少以及氧脂的增加分别与脂肪酸的β氧化和脂肪酸的加氧反应有关；大量的脂肪酸氧化产物acetyl-CoA诱导了isocitrate lyase的表达促进了glyoxylate的生成；部分acetyl-CoA还通过acetylcarnitine进入了三羧酸循环，用于AaIT、beauverolides和其它化合物的合成；此外，大量acetyl-CoA还激活了pyruvate carboxylase，促进糖异生代谢，使trehalose含量升高。这些代谢物变化揭示了细胞中氧化反应的增强。相应的，细胞内的氧化胁迫保护剂，如ergothioneine、trehalose含量的增加表明菌丝细胞受到氧化胁迫并且细胞的保护反应被诱导。工程菌株中糖、脂、肉碱的改变表明B. bassiana的能量代谢受到了外源基因的干扰。能量代谢是物质代谢的动力，可能正是因为转基因菌株的能量代谢受到扰动，使得菌丝代谢物出现了全面调整。与菌丝相比，转基因菌株的孢子中除了同样有明显的磷酯类代谢物降低外，其它与氧化胁迫有关的代谢物，如carnitine、oxylipin、trehalose、mannitol等要么没有明显变化要么含量下降，表明外源基因对细胞产生的氧化胁迫是在其转录和翻译的过程中产生的，当外源基因在孢子中处于休眠状态时，没有明显的氧化胁迫作用。2球孢白僵菌的萌发和毒力标记物的识别B. bassiana广泛用于农业害虫的防治，其孢子萌发率和对昆虫的毒力是判断其应用价值的重要指标。本研究对B. bassiana7个菌株的孢子进行萌发率和对茶毛虫毒力进行测定，同时对其菌丝和孢子的代谢物进行LC-MS分析，采用基于LC-MS的代谢组学方法识别菌丝和孢子中与萌发和毒力有关的标记物。结果表明高毒力菌株的菌丝中具有高含量的carnitine、hercynine、acetylcarnitine、α,α-trehalose; Octa-Me、arg-arg-gln、PE(18:2/0:0)、PC(18:3/0:0) and PC(18:2/0:0))。高萌发率的孢子中具有高含量的2,3-dimethylmaleate、 acetylcarnitine、propionyl-carnitine和PC(18:2/0:0)。高毒力的孢子中具有高含量的histamine、V-PYRRO/NO、carnitine、acetylcarnitine、propionyl-carnitine、butyryl carnitine、PE(18:2/0:0)、PC(16:1/0:0)和PC(18:3/0:0)。此外，通过对菌丝中各种杀虫肽beauverolides，beauvericins和bassianolide的含量比较，发现单独一种肽的含量高低与菌株对茶毛虫的毒力没有直接关系，但高毒力Bb1898中的9种肽同时具有较高的含量暗示它们可能发挥协同作用。本研究发现毒力和萌发的共同标记物是脂酰肉碱和磷脂，它们具有维持附着胞膨压和为穿透寄主提供能量的功能，因此附着和穿透能力是决定球孢白僵菌毒力的关键，而它们也与孢子萌发有关属首次报道。此外，还有其它标记物，如高毒力菌丝中的hercynine和α,α-trehalose;Octa-Me；高萌发率孢子中的2,3-dimethylmaleate，高毒力孢子中的histamine和V-PYRRO/NO，它们的作用原理有待进一步研究。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
1 综述  10-16
  1.1 虫生真菌工程菌株的研究进展  10-11
    1.1.1 脂酶(lipase)  10
    1.1.2 几丁质酶(chitinase)  10
    1.1.3 类枯草杆菌蛋白酶(Pr1)  10
    1.1.4 蝎神经毒素(AaIT)  10-11
    1.1.5 Bt 晶体杀虫蛋白(Cry1Ac)  11
    1.1.6 Bt 营养期杀虫蛋白(VIP3A)  11
  1.2 虫生真菌萌发和毒力因子的研究进展  11-12
  1.3 代谢组学的研究进展  12-16
    1.3.1 分析仪器  12
    1.3.2 样品处理  12-13
    1.3.3 数据处理  13
    1.3.4 化学计量学方法  13-14
    1.3.5 代谢组学应用  14-16
2 引言  16-18
3 材料与方法  18-21
  3.1 外源基因对球孢白僵菌的代谢影响  18
    3.1.1 菌株和培养  18
    3.1.2 样品处理  18
  3.2 球孢白僵菌萌发和毒力标记物的识别  18-19
    3.2.1 菌株和培养  18
    3.2.2 萌发率测试  18
    3.2.3 毒力测试  18-19
    3.2.4 样品处理  19
  3.3 主要仪器与试剂  19
  3.4 HPLC-MS  19
  3.5 数据处理  19-20
  3.6 统计分析  20
  3.7 代谢物识别  20-21
4 结果与分析  21-40
  4.1 外源基因对球孢白僵菌的代谢影响  21-33
    4.1.1 多变量数据分析  21-27
    4.1.2 热图分析  27-30
    4.1.3 途经分析  30-33
  4.2 球孢白僵菌萌发和毒力标记物的识别  33-40
    4.2.1 菌株的萌发率和毒力  33
    4.2.2 菌丝中毒力标记物  33-35
    4.2.3 孢子中萌发和毒力标记物  35-38
    4.2.4 菌丝中杀虫肽的含量  38-40
5 讨论  40-42
  5.1 外源基因对球孢白僵菌的代谢影响  40
  5.2 球孢白僵菌萌发和毒力标记物的识别  40-42
6 结论  42-43
  6.1 外源基因对球孢白僵菌的代谢影响  42
  6.2 球孢白僵菌萌发和毒力标记物的识别  42-43
参考文献  43-51
致谢  51-52
作者简介  52
攻读硕士期间发表的学术论文目录  52

球孢白僵菌萌发和毒力标记物及外源基因对其代谢组影响

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