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云南元谋植原体病害多位点基因分子特性及相关株系的保存研究

作　者: 万琼莲
导　师: 蔡红
学　校: 云南农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 植原体16S rRNA rp基因 secY基因植原体膜蛋白组织培养
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

植原体是一类没有细胞壁，寄生在植物韧皮部筛管细胞中的病原原核生物，能够引起多种植物病害，造成巨大损失，目前尚不能人工培养。本研究利用云南元谋地区植原体材料丰富的优势，主要做了三方面的研究：采用分子生物学方法，对该地疑似植原体病害的病株进行总DNA的提取，针对植原体保守基因16S rRNA，核糖体蛋白rp基因，转运蛋白secY基因和免疫膜蛋白Imp基因进行PCR扩增、扩增产物克隆及序列测定，从多个位点对其植原体株系进行分析和鉴定，明确其分类地位；对植原体免疫膜蛋白Imp基因进行了蛋白特性分析、功能结构预测和原核表达；对植原体病株采用组织培养的方法进行长期低温保存进行了初步探究。主要研究结果如下：1)本研究共鉴定了7种植原体病害，其中刀豆丛枝病是国内外首次发现；花椰菜丛枝病和豇豆花变绿病是国内首次发现；花椰菜丛枝病、番茄丛枝病和银胶菊花变绿病是云南首次报道。并从16S rDNA、rp和secY三个基因水平上对这七个植原体进行了分类和鉴定，结果表明这七种植原体都属于花生丛枝植原体（CandidatusPhytoplasma australasiae，16S rII）的16SrII-A亚组。通过分析rp序列及其进化树发现，它们与花生丛枝（PnWB）、甘薯丛枝（SPWB）、芝麻花变叶（SEPN, SEPT）以及苜蓿丛枝等候选种Ca.P.australasia株系聚为同一亚进化支（iii），通过分析secY序列及其进化树发现，它们与16SrII-A亚组的PnWB，SEPT，SEPN，SPWB和16SrII-D亚组的TBB同源性较高，三个基因序列的分析结果一致。2）通过设计引物IMP(II)F和IMP(II)R对元谋地区发现的7种植原体病害的Imp基因进行了扩增，都获得了519bp的目的基因。通过生物学软件进行比对，并对其进行蛋白特性及结构预测得出它们的膜蛋白属于Type I型。通过对其跨膜区进行预测发现，根据3个16SrII亚组的植原体免疫膜蛋白Type I的N端和C端在膜内外的位置不同可以把Type I型蛋白分为Type I-A、B，本研究所获得的IMP都属于Type I-B型。通过对IMP前导信号肽以及表面抗原性预测等进行预测发现，本研究获得的IMP在N端均不具有信号肽，并且表明有9个明显的抗原决定簇，我们还对花生丛枝植原体（PnWB）和银胶菊花变绿植原体（ParVP）的IMP蛋白进行了原核表达，获得了两种植原体的重组表达载体pET30a-Imp，通过SDS-page检测获得了预期表达约25kDa的蛋白，同时构建了其它5种植原体的重组表达载体pET30a-Imp，但未正常表达。这为抗血清的制备以及植原体的检测奠定了理论基础。3）通过对花椰菜丛枝植株和蟹爪兰丛枝植株进行组织培养，并对其进行分子检测，结果显示可以对花椰菜丛枝植原体共生植株进行组织培养，经过长期低温继代培养后，组培苗中仍然含有植原体，说明组织培养法可用于保存植原体，有利于对植原体进行随时随地的取材研究，解决植原体研究因寄主地域性和季节不稳定性造成局限的问题，得出结论：将待研究的相关植原体株系嫁接到适合长期低温培养的植物中进行继代培养和冷藏保存，并实时监控植原体的含量和变异情况，能为建立一个长期有效的保存植原体的机制奠定基础。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
1 引言  11-34
  1.1 植原体的研究概况  11-24
    1.1.1 植原体的基本特征和发现  11
    1.1.2 植原体的危害、分布与传播  11-12
    1.1.3 植原体的寄主专化性  12-13
    1.1.4 植原体基因组  13-14
    1.1.5 植原体的检测  14-16
    1.1.6 植原体的分类  16-21
    1.1.7 相关植原体病害研究进展  21-24
  1.2 植原体寄主的组织培养研究  24-26
    1.2.1 植原体组织培养的研究背景  24
    1.2.2 植原体组织培养存在的问题  24-25
    1.2.3 植原体组织培养的目的和意义  25
    1.2.4 植原体组织培养的展望  25
    1.2.5 植原体资源的保存  25-26
  1.3 植原体膜蛋白的研究  26-31
    1.3.1 植原体的免疫膜蛋白及其分类  26-29
    1.3.2 Sec 系统膜蛋白  29-30
    1.3.3 植原体膜蛋白的应用  30-31
  1.4 研究的目的意义和技术路线  31-34
2 七种植原体病害多位点基因分子鉴定  34-60
  2.1 实验材料  34
    2.1.1 材料来源  34
    2.1.2 主要试剂材料  34
  2.2 实验方法  34-39
    2.2.1 感病植株总 DNA 提取  34-35
    2.2.2 引物合成  35
    2.2.3 PCR 扩增体系  35-36
    2.2.4 PCR 产物的割胶纯化  36
    2.2.5 连接  36-37
    2.2.6 感受态细胞制备  37
    2.2.7 转化与克隆  37-38
    2.2.8 数据分析  38-39
  2.3 结果与分析  39-57
    2.3.0 七种植原体症状表现  39-42
    2.3.1 植原体在电子显微镜下形态观察  42-43
    2.3.2 七种植原体基因扩增结果  43-44
    2.3.3 七种植原体的 16SrDNA 的序列分析及基于系统进化树的分析  44-51
    2.3.4 七种植原体的 rp 基因序列的分析及基于系统进化树的分析  51-54
    2.3.5 七种植原体的 secY 基因的序列分析及基于系统进化树的分析  54-57
  2.4 讨论  57-60
    2.4.1 关于多位点序列分析的讨论  57
    2.4.2 关于云南元谋地区植原体病害分子鉴定的讨论  57-58
    2.4.3 关于不同地区相同寄主植原体的讨论  58
    2.4.4 关于云南元谋地区植原体的分布情况  58-60
3 免疫膜蛋白初步研究  60-75
  3.1 材料与方法  60-61
    3.1.1 植原体材料  60
    3.1.2 菌株、载体和主要试剂  60-61
  3.2 方法  61-66
    3.2.1 引物设计  61
    3.2.2 PCR 扩增体系  61-62
    3.2.3 PCR 产物的割胶纯化  62
    3.2.4 产物的加 A，连接，转化及克隆测序  62
    3.2.5 质粒提取  62-63
    3.2.6 pMD19-T 重组克隆的筛选  63
    3.2.7 原核表达载体的构建策略  63-64
    3.2.8 原核表达载体的构建  64-65
    3.2.9 重组基因的原核表达  65-66
  3.3 结果与分析  66-72
    3.3.1 扩增结果  66-67
    3.3.2 免疫膜蛋白的同源性分析  67
    3.3.3 Imp 蛋白特性分析及空间结构预测  67-71
    3.3.4 PnWB 和 ParVP 的 Imp 原核表达重组质粒的酶切鉴定  71-72
    3.3.5 PnWB 和 ParVP 的 IMP 原核表达  72
  3.4 讨论  72-75
    3.4.1 免疫膜蛋白 Type I 新类型  72-73
    3.4.2 免疫膜蛋白和 16S rDNA 的相关性  73
    3.4.3 植原体膜蛋白的多样性及其功能  73-74
    3.4.4 膜蛋白基因重组质粒的表达  74-75
4 植原体共生植株的保存研究  75-86
  4.1 实验材料  75
  4.2 实验方法  75-77
    4.2.1 外植体的灭菌与接种  75
    4.2.2 初代培养和继代培养  75-76
    4.2.3 培养条件  76
    4.2.4 营养繁殖体的低温保存  76
    4.2.5 组培苗植原体的分子检测  76
    4.2.6 实验数据处理和分析  76-77
  4.3 结果与分析  77-83
    4.3.1 花椰菜丛枝植原体共生植株的培养结果  77-80
    4.3.2 蟹爪兰丛枝植原体组织培养的观察结果  80-83
    4.3.3 组培苗分子检测结果  83
  4.4 讨论  83-86
    4.4.1 组织培养中存在的污染、褐化、黄化和玻璃化问题  83-84
    4.4.2 花椰菜丛枝植原体共生植株的培养以及冷藏保存  84
    4.4.3 蟹爪兰丛枝植原体共生植株的培养以及冷藏保存  84-85
    4.4.4 植原体共生植株的培养  85-86
5 结论和展望  86-88
  5.1 结论  86
    5.1.1 分子生物学方法鉴定了云南元谋地区七个植原体株系  86
    5.1.2 对两种植原体株系的 IMP 蛋白进行了表达  86
    5.1.3 保存了花椰菜植原体共生植株和蟹爪兰植原体共生植株  86
  5.2 本研究创新点  86-87
  5.3 展望  87-88
参考文献  88-97
附录 1 常用的化学试剂量、分子生物试剂和仪器  97-98
附录 2 常用试剂的配制  98-99
附录 3 缩略词  99-100
致谢  100

云南元谋植原体病害多位点基因分子特性及相关株系的保存研究

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