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RNA干扰抑制草鱼呼肠孤病毒复制的细胞模型
作 者: 李兵
导 师: 曾令兵
学 校: 华中农业大学
专 业: 水产养殖
关键词: 草鱼 草鱼出血病 草鱼呼肠孤病毒 复制 RNA干扰 抑制 病毒滴度 组织培养半数感染剂量 mRNA水平
分类号: S941
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖对象。草鱼出血病是草鱼最为严重的疾病之一,死亡率高达90%,造成重大的经济损失。目前对该病尚缺乏有效的防治方法。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指小的RNA干扰分子(Small interfering RNA, siRNA)特异性地抑制同源基因的表达,它是广泛存在于生物中的一种基因沉默现象。由于RNAi具有高度特异性和高效性,可以作为抑制特定基因表达的工具。本研究利用RNAi技术,在草鱼肾脏细胞系(Ctenopharyngodon idellus Kidney, CIK)上建立抑制草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)复制的模型,以期为定向抗病毒草鱼分子育种技术研究奠定前期基础。本论文主要进行了以下几个方面的研究:1.在CIK细胞上大量增殖GCRV病毒,提取病毒的核酸,反转录得到cDNA,以cDNA为模板进行PCR,扩增产物连接到T载体,转化大肠杆菌感受态细胞,提取质粒进行PCR鉴定,将阳性克隆测序,得到GCRV的部分基因片段序列。2.采用化学合成法分别合成靶向草鱼呼肠孤病毒RNA分段基因组L2片段上的RNA聚合酶基因(RdRp)和S10片段上的外衣壳蛋白基因(OCP)的小干涉RNA分子siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117。用Lipofectamine 2000转染CIK细胞。转染6h后用GCRV感染细胞,48h后收集感染细胞的培养液,测定病毒TCID50/0.1mL值。Trizol试剂盒提取感染细胞的总RNA,以细胞管家基因β-actin mRNA水平为参照,采用RT-PCR检测呼肠孤病毒siRNAs靶基因的mRNA水平。病毒滴度测定结果表明:转染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后细胞培养液的病毒滴度分别为104.41±0.16、103.83±0.44和101.94±0.42,极显著低于病毒感染阳性对照组的病毒滴度(107.92±0.52,p<0.01),转染siRNA阴性对照组的病毒滴度为107.50±0.17,与病毒感染阳性对照相比,差异不显著(p>0.05)。RT-PCR检测结果显示:与病毒感染阳性对照相比,转染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后的CIK细胞中GCRV mRNA水平显著下降(p<0.01),抑制率分别为82.08±2.15%、89.19±1.14%、92.96±0.17%,而转染siRNA阴性对照对GVRV mRNA的水平没有显著的影响(p>0.05)。结论:针对RNA聚合酶基因和外衣壳蛋白基因设计并化学合成的siRNA特异、高效地抑制了草鱼呼肠孤病毒的复制。3.针对GCRV RNA聚合酶基因和外衣壳蛋白基因的3个位点,设计并合成了长度为63bp、5’端磷酸化用于质粒表达的3段含siRNA特异序列的寡聚脱氧核糖核苷酸正链和负链,经退火,克隆入pSilencer 2.1-U6 neo载体U6启动子下游,构建了表达质粒pSi-RdRp1286、pSi-RdRP1441及pSi-OCP117,将表达质粒进行PCR鉴定并克隆测序。结果表明成功的构建了表达质粒pSi-RdRp1286、pSi-RdRp1441、pSi-OCP117。
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全文目录
摘要 8-10 ABSTRACT 10-12 缩略语表(按字母顺序排列) 12-13 第一章 文献综述 13-25 1 草鱼出血病简介 13-15 1.1 草鱼出血病的研究历史 13-14 1.2 草鱼出血病的症状及流行情况 14-15 1.3 草鱼呼肠孤病毒的生物学特性 15 1.4 草鱼出血病的防治方法 15 2 RNAI技术 15-21 2.1 RNAi的发展过程 16-17 2.2 RNAi的作用机制 17-18 2.2.1 转录后水平上的RNAi机制 17 2.2.2 翻译水平上的RNAi机制 17-18 2.2.3 转录水平上的RNAi机制 18 2.3 RNAi的特点 18 2.4 siRNA的制备 18-20 2.4.1 化学合成法 18 2.4.2 体外转录法 18 2.4.3 RNaseⅢ消化法 18-19 2.4.4 siRNA表达载体 19 2.4.5 siRNA表达框架 19 2.4.6 慢病毒载体表达的siRNA 19-20 2.5 RNAi技术的用途 20-21 3 RNAI在水产科学中的应用 21-24 3.1 RNAi在抑制水生动物病毒方面的应用 21-23 3.1.1 抑制真鲷虹彩病毒 21 3.1.2 抑制对虾白斑综合症病毒 21-22 3.1.3 抑制蛙病毒 22 3.1.4 抑制草鱼呼肠孤病毒 22-23 3.2 RNAi在水产动物基因功能方面的应用 23-24 4 问题与展望 24-25 第二章 GCRV部分基因片段的克隆 25-38 1 材料与方法 25-31 1.1 仪器与设备 25-26 1.2 材料与试剂 26 1.3 所用软件 26 1.4 试验方法 26-31 1.4.1 CIK细胞复苏 26 1.4.2 CIK细胞传代培养 26 1.4.3 GCRV在CIK细胞中增殖 26-27 1.4.4 病毒的滴度测定 27 1.4.5 提取病毒的RNA 27 1.4.6 GCRV聚丙烯酰胺凝胶电泳 27-29 1.4.7 GCRV部分基因片段的克隆及测序 29-31 2 结果 31-36 2.1 病毒滴度测定结果 31-33 2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 33 2.3 质粒检测结果 33-34 2.4 质粒测序结果 34-35 2.5 测序后比对结果 35-36 3 讨论 36-37 4 小结 37-38 第三章 化学合成的SIRNA在细胞上抑制GCRV复制 38-56 1 材料与方法 38-42 1.1 仪器与设备 38 1.2 材料与试剂 38 1.3 所用软件 38 1.4 试验方法 38-42 1.4.1 设计并合成siRNA 38-40 1.4.2 脂质体转染 40 1.4.3 转染siRNA对GCRV的抑制作用 40-41 1.4.4 转染siRNA对病毒滴度的影响 41 1.4.5 转染siRNA对病毒mRNA水平的影响 41-42 2 结果 42-53 2.1 siRNA设计结果 42-43 2.2 转染siRNA对病毒的抑制作用 43-45 2.3 转染siRNA对病毒滴度的影响 45-50 2.3.1 病毒感染阳性对照的滴度测定结果 45-46 2.3.2 转染siRNA-RdRp1286的细胞培养液滴度测定结果 46-47 2.3.3 转染siRNA-RdRp1441的细胞培养液滴度测定结果 47-48 2.3.4 转染siRNA-OCP117的细胞培养液滴度测定结果 48-49 2.3.5 转染siRNA阴性对照的细胞培养液滴度测定结果 49-50 2.4 转染siRNA对GCRV mRNA水平的影响 50-53 3 讨论 53-55 4 小结 55-56 第四章 SIRNA表达质粒的构建 56-67 1 实验材料 56-57 1.1 仪器与设备 56 1.2 材料与试剂 56-57 1.3 所用软件 57 2 实验方法 57-60 2.1 GCRV基因特异性siRNA的设计 57 2.2 siRNA表达质粒的构建 57-60 2.2.1 插入片段的准备 57 2.2.2 线性质粒与插入片段的连接 57 2.2.3 连接产物转化大肠杆菌感受态 57-58 2.2.4 质粒提取 58-59 2.2.5 表达质粒的鉴定 59-60 2.3 表达质粒的脂质体转染 60 2.3.1 脂质体转染 60 2.3.2 转染表达质粒对细胞生长的影响 60 2.3.3 质粒转染的检测 60 3 结果 60-65 3.1 含GCRV siRNA特异序列的寡核苷酸单链的设计与合成 60-62 3.2 表达质粒的PCR鉴定 62 3.3 表达质粒的测序鉴定 62-63 3.4 转染表达质粒对CIK细胞生长的影响 63-64 3.5 表达质粒转染的检测结果 64-65 4 讨论 65-66 5 小结 66-67 结语 67-68 参考文献 68-74 附录:研究生期间发表的文章 74-75 致谢 75
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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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