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RNA干扰抑制草鱼呼肠孤病毒复制的细胞模型

作 者: 李兵
导 师: 曾令兵
学 校: 华中农业大学
专 业: 水产养殖
关键词: 草鱼 草鱼出血病 草鱼呼肠孤病毒 复制 RNA干扰 抑制 病毒滴度 组织培养半数感染剂量 mRNA水平
分类号: S941
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
下 载: 79次
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内容摘要


草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖对象。草鱼出血病是草鱼最为严重的疾病之一,死亡率高达90%,造成重大的经济损失。目前对该病尚缺乏有效的防治方法。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指小的RNA干扰分子(Small interfering RNA, siRNA)特异性地抑制同源基因的表达,它是广泛存在于生物中的一种基因沉默现象。由于RNAi具有高度特异性和高效性,可以作为抑制特定基因表达的工具。本研究利用RNAi技术,在草鱼肾脏细胞系(Ctenopharyngodon idellus Kidney, CIK)上建立抑制草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)复制的模型,以期为定向抗病毒草鱼分子育种技术研究奠定前期基础。本论文主要进行了以下几个方面的研究:1.在CIK细胞上大量增殖GCRV病毒,提取病毒的核酸,反转录得到cDNA,以cDNA为模板进行PCR,扩增产物连接到T载体,转化大肠杆菌感受态细胞,提取质粒进行PCR鉴定,将阳性克隆测序,得到GCRV的部分基因片段序列。2.采用化学合成法分别合成靶向草鱼呼肠孤病毒RNA分段基因组L2片段上的RNA聚合酶基因(RdRp)和S10片段上的外衣壳蛋白基因(OCP)的小干涉RNA分子siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117。用Lipofectamine 2000转染CIK细胞。转染6h后用GCRV感染细胞,48h后收集感染细胞的培养液,测定病毒TCID50/0.1mL值。Trizol试剂盒提取感染细胞的总RNA,以细胞管家基因β-actin mRNA水平为参照,采用RT-PCR检测呼肠孤病毒siRNAs靶基因的mRNA水平。病毒滴度测定结果表明:转染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后细胞培养液的病毒滴度分别为104.41±0.16、103.83±0.44和101.94±0.42,极显著低于病毒感染阳性对照组的病毒滴度(107.92±0.52,p<0.01),转染siRNA阴性对照组的病毒滴度为107.50±0.17,与病毒感染阳性对照相比,差异不显著(p>0.05)。RT-PCR检测结果显示:与病毒感染阳性对照相比,转染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后的CIK细胞中GCRV mRNA水平显著下降(p<0.01),抑制率分别为82.08±2.15%、89.19±1.14%、92.96±0.17%,而转染siRNA阴性对照对GVRV mRNA的水平没有显著的影响(p>0.05)。结论:针对RNA聚合酶基因和外衣壳蛋白基因设计并化学合成的siRNA特异、高效地抑制了草鱼呼肠孤病毒的复制。3.针对GCRV RNA聚合酶基因和外衣壳蛋白基因的3个位点,设计并合成了长度为63bp、5’端磷酸化用于质粒表达的3段含siRNA特异序列的寡聚脱氧核糖核苷酸正链和负链,经退火,克隆入pSilencer 2.1-U6 neo载体U6启动子下游,构建了表达质粒pSi-RdRp1286、pSi-RdRP1441及pSi-OCP117,将表达质粒进行PCR鉴定并克隆测序。结果表明成功的构建了表达质粒pSi-RdRp1286、pSi-RdRp1441、pSi-OCP117。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩略语表(按字母顺序排列)  12-13
第一章 文献综述  13-25
  1 草鱼出血病简介  13-15
    1.1 草鱼出血病的研究历史  13-14
    1.2 草鱼出血病的症状及流行情况  14-15
    1.3 草鱼呼肠孤病毒的生物学特性  15
    1.4 草鱼出血病的防治方法  15
  2 RNAI技术  15-21
    2.1 RNAi的发展过程  16-17
    2.2 RNAi的作用机制  17-18
      2.2.1 转录后水平上的RNAi机制  17
      2.2.2 翻译水平上的RNAi机制  17-18
      2.2.3 转录水平上的RNAi机制  18
    2.3 RNAi的特点  18
    2.4 siRNA的制备  18-20
      2.4.1 化学合成法  18
      2.4.2 体外转录法  18
      2.4.3 RNaseⅢ消化法  18-19
      2.4.4 siRNA表达载体  19
      2.4.5 siRNA表达框架  19
      2.4.6 慢病毒载体表达的siRNA  19-20
    2.5 RNAi技术的用途  20-21
  3 RNAI在水产科学中的应用  21-24
    3.1 RNAi在抑制水生动物病毒方面的应用  21-23
      3.1.1 抑制真鲷虹彩病毒  21
      3.1.2 抑制对虾白斑综合症病毒  21-22
      3.1.3 抑制蛙病毒  22
      3.1.4 抑制草鱼呼肠孤病毒  22-23
    3.2 RNAi在水产动物基因功能方面的应用  23-24
  4 问题与展望  24-25
第二章 GCRV部分基因片段的克隆  25-38
  1 材料与方法  25-31
    1.1 仪器与设备  25-26
    1.2 材料与试剂  26
    1.3 所用软件  26
    1.4 试验方法  26-31
      1.4.1 CIK细胞复苏  26
      1.4.2 CIK细胞传代培养  26
      1.4.3 GCRV在CIK细胞中增殖  26-27
      1.4.4 病毒的滴度测定  27
      1.4.5 提取病毒的RNA  27
      1.4.6 GCRV聚丙烯酰胺凝胶电泳  27-29
      1.4.7 GCRV部分基因片段的克隆及测序  29-31
  2 结果  31-36
    2.1 病毒滴度测定结果  31-33
    2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果  33
    2.3 质粒检测结果  33-34
    2.4 质粒测序结果  34-35
    2.5 测序后比对结果  35-36
  3 讨论  36-37
  4 小结  37-38
第三章 化学合成的SIRNA在细胞上抑制GCRV复制  38-56
  1 材料与方法  38-42
    1.1 仪器与设备  38
    1.2 材料与试剂  38
    1.3 所用软件  38
    1.4 试验方法  38-42
      1.4.1 设计并合成siRNA  38-40
      1.4.2 脂质体转染  40
      1.4.3 转染siRNA对GCRV的抑制作用  40-41
      1.4.4 转染siRNA对病毒滴度的影响  41
      1.4.5 转染siRNA对病毒mRNA水平的影响  41-42
  2 结果  42-53
    2.1 siRNA设计结果  42-43
    2.2 转染siRNA对病毒的抑制作用  43-45
    2.3 转染siRNA对病毒滴度的影响  45-50
      2.3.1 病毒感染阳性对照的滴度测定结果  45-46
      2.3.2 转染siRNA-RdRp1286的细胞培养液滴度测定结果  46-47
      2.3.3 转染siRNA-RdRp1441的细胞培养液滴度测定结果  47-48
      2.3.4 转染siRNA-OCP117的细胞培养液滴度测定结果  48-49
      2.3.5 转染siRNA阴性对照的细胞培养液滴度测定结果  49-50
    2.4 转染siRNA对GCRV mRNA水平的影响  50-53
  3 讨论  53-55
  4 小结  55-56
第四章 SIRNA表达质粒的构建  56-67
  1 实验材料  56-57
    1.1 仪器与设备  56
    1.2 材料与试剂  56-57
    1.3 所用软件  57
  2 实验方法  57-60
    2.1 GCRV基因特异性siRNA的设计  57
    2.2 siRNA表达质粒的构建  57-60
      2.2.1 插入片段的准备  57
      2.2.2 线性质粒与插入片段的连接  57
      2.2.3 连接产物转化大肠杆菌感受态  57-58
      2.2.4 质粒提取  58-59
      2.2.5 表达质粒的鉴定  59-60
    2.3 表达质粒的脂质体转染  60
      2.3.1 脂质体转染  60
      2.3.2 转染表达质粒对细胞生长的影响  60
      2.3.3 质粒转染的检测  60
  3 结果  60-65
    3.1 含GCRV siRNA特异序列的寡核苷酸单链的设计与合成  60-62
    3.2 表达质粒的PCR鉴定  62
    3.3 表达质粒的测序鉴定  62-63
    3.4 转染表达质粒对CIK细胞生长的影响  63-64
    3.5 表达质粒转染的检测结果  64-65
  4 讨论  65-66
  5 小结  66-67
结语  67-68
参考文献  68-74
附录:研究生期间发表的文章  74-75
致谢  75

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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