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代谢工程改造酿酒酵母生产（S）-芳樟醇

作　者: 孙明雪
导　师: 陈坚
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 酿酒酵母 (S)-芳樟醇类异戊二烯合成途径代谢工程
分类号: TS261.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

(S)-芳樟醇属于非环单萜醇，是一种植物次级代谢产物，在食品、香化、医药、日化等领域均具有重要应用价值。本论文利用分子生物学技术和代谢工程手段，对代谢途径上关键酶分子的空间组织进行改造，或强化酿酒酵母类异戊二烯合成途径的代谢通量，增加前体物质的供给，提高发酵液中(S)-芳樟醇的积累。本论文主要结论如下：1．(S)-芳樟醇合成酶的异源表达。(1)在酿酒酵母中表达来源于猕猴桃Actinidiaarguta和Actinidia polygama的(S)-芳樟醇合成酶基因AaLS1与ApLS1，构建两基因表达载体，筛选得到相应重组菌株。取适量发酵液，采用GC-MS进行检测。结果显示，表达AaLS1基因使(S)-芳樟醇产量达到59.85g/L，表达ApLS1基因使(S)-芳樟醇产量达到21.32g/L，对照菌株未检测出(S)-芳樟醇，表明在酿酒酵母中实现(S)-芳樟醇的积累。(2)将表达载体pY26-AaLS1分别导入酿酒酵母单倍体菌株CEN.PK2-1C (MATα)、CEN.PK2-1D (MATa)和二倍体菌株CEN.PK2(MATa/MATα)，经GC-MS检测发酵液，(S)-芳樟醇产量未发生显著变化，表明不同交配型可能不影响(S)-芳樟醇合成。(3)为了提高(S)-芳樟醇产量，将法尼基焦磷酸合成酶K197位点进行定点突变，赖氨酸(K)分别突变为甘氨酸(G)和谷氨酸(E)，检测结果表明该位点突变未对(S)-芳樟醇合成造成显著影响。2．采用基因融合技术，将(S)-芳樟醇合成酶与法尼基焦磷酸合成酶使用不同长度的连接肽连接，并通过改变两种酶的取向成功构建6个不同的融合基因，构建融合基因表达载体，筛选得到相应重组菌株。(1)检测结果表明，融合蛋白的构建使(S)-芳樟醇最高产量达到101.55g/L，比单独表达(S)-芳樟醇合成酶提高69.7%。与短中长度连接肽(GGGS、(GGSG)2)相比，使用长柔性连接肽(GGGGS)3，使(S)-芳樟醇产量提高36.67%。与FPPS-LIS形式相比，以LIS-FPPS空间组织方式构成的融合酶使(S)-芳樟醇产量提高2.5倍。证明选择连接肽的类型和融合酶的组成结构对两酶活性可能有显著的影响，从而导致目的产物合成量不同。(2)麦角固醇是类异戊二烯合成途径终产物甾醇的主要前体物质，其含量变化能够反应代谢途径上的代谢流的变化。采用紫外分光光度法测定酿酒酵母麦角固醇含量，研究表明，麦角固醇含量随着(S)-芳樟醇产量的提高而减少，表明融合酶的构建可以影响代谢流的变化。(3)对重组菌株乙醇耐受性的研究表明，与对照菌株相比重组菌株乙醇耐受性未发生显著变化，表明融合酶的构建及(S)-芳樟醇的积累不会对菌株造成致命影响。3．基因工程菌株LS02过量表达IDI1基因。摇瓶发酵结果表明，调控IDI1基因的表达，使(S)-芳樟醇含量提高了69.6%，达到101.46μg/L，单位细胞(S)-芳樟醇含量提高从8.61g/g DCW提高至15.24g/g DCW。基因工程菌株LS03过量表达IDI1与tHMG1基因。摇瓶发酵结果表明，在调控IDI1基因的基础上，进一步提高HMG-CoA还原酶水平，使(S)-芳樟醇产量提高至127.71g/L，单位细胞(S)-芳樟醇含量提高9.4%，增加至16.66g/g DCW。通过对工程菌株生长曲线进行检测，发现表达tHMG1基因使菌体生长有一定程度提高，可能由于代谢流增加对菌体生长有促进作用。同时表明在酿酒酵母工程菌合成(S)-芳樟醇过程中，(S)-芳樟醇的积累未对菌株生长造成显著影响。麦角固醇含量测定结果表明，在表达IDI1基因和tHMG1基因后麦角固醇合成量从14.26mg/gDCW增加至17.68mg/g DCW。结果表明，调控IDI1和tHMG1基因可以增加麦角固醇合成量，同时可以推测两基因的表达有利于强化类异戊二烯代谢途径，有效地加强碳代谢流，并最终促进了(S)-芳樟醇的合成。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章绪论  10-19
  1.1 概述  10-11
    1.1.1 萜类化合物分类及应用  10
    1.1.2 萜类化合物的主要生产方法  10-11
  1.2 酿酒酵母生产萜类化合物的研究进展  11-14
    1.2.1 酿酒酵母的优势  11
    1.2.2 酿酒酵母合成萜类化合物的生物途径  11-13
    1.2.3 酿酒酵母萜类代谢途径上的关键酶  13-14
  1.3 代谢工程改造酿酒酵母合成萜类化合物的研究策略  14-15
    1.3.1 改造代谢途径上关键酶分子的空间组织结构  14-15
    1.3.2 调控 MVA 代谢途径增加前体物质的供给  15
    1.3.3 其他方法  15
  1.4 代谢工程改造酿酒酵母合成萜类化合物的研究进展  15-16
    1.4.1 代谢工程改造酿酒酵母合成萜类化合物的国内外研究现状  15-16
    1.4 2 代谢工程改造酿酒酵母生产单萜化合物面临的问题  16
  1.5 立题依据及意义  16-17
    1.5.1 通过酶空间靠近效应促进(S)-芳樟醇合成  16-17
    1.5.2 调控类异戊二烯合成途径促进(S)-芳樟醇生产  17
    1.5.3 本课题研究的意义  17
  1.6 本论文主要研究内容  17-19
第二章材料与方法  19-29
  2.1 菌株与质粒  19
  2.2 培养基  19
  2.3 试剂与仪器  19-20
    2.3.1 主要试剂  19-20
    2.3.2 主要仪器  20
  2.4 培养方法  20-21
  2.5 分子生物学操作  21-27
    2.5.1 DNA 操作方法  21
    2.5.2 AaLS1 与 ApLS1 基因游离表达载体的构建  21-22
    2.5.3 ERG20 基因的定点突变及其表达载体的构建  22-23
    2.5.4 融合酶基因表达载体的构建  23
    2.5.5 IDI1 基因表达载体构建  23-26
    2.5.6 tHMG1 基因整合表达载体的构建  26
    2.5.7 重组菌株的构建  26-27
  2.6 测定与分析方法  27-29
    2.6.1 气相色谱与质谱(GC-MS)分析与检测  27
    2.6.2 麦角固醇的测定[47]  27-28
    2.6.3 乙醇耐受性的测定  28
    2.6.4 其他参数的测定  28-29
第三章结果与讨论  29-41
  3.1 (S)-芳樟醇合成酶在酿酒酵母中的表达  29-32
    3.1.1 AaLS1 与 ApLS1 基因的扩增及其表达载体的构建  29
    3.1.2 ERG20 基因的定点突变及其表达载体的构建  29-30
    3.1.3 酿酒酵母工程菌株的构建  30-31
    3.1.4 (S)-芳樟醇产量分析  31
    3.1.5 讨论  31-32
  3.2 融合表达对(S)-芳樟醇产量的影响  32-36
    3.2.1 融合基因表达载体的构建  32-33
    3.2.2 表达融合酶对(S)-芳樟醇产量的影响  33
    3.2.3 表达融合酶对麦角固醇含量的影响  33-35
    3.2.4 表达融合酶对乙醇耐受性的影响  35
    3.2.5 讨论  35-36
  3.3 调控酿酒酵母类异戊二烯合成途径强化(S)-芳樟醇合成  36-41
    3.3.1 IDI1 基因表达载体的构建  37
    3.3.2 tHMG1 基因表达载体的构建  37-38
    3.3.3 酿酒酵母工程菌株的构建  38
    3.3.4 调控类异戊二烯合成途径对(S)-芳樟醇产量的影响  38-39
    3.3.5 调控类异戊二烯合成途径对麦角固醇含量的影响  39-40
    3.3.6 讨论  40-41
主要结论与展望  41-43
  主要结论  41
  展望  41-43
致谢  43-44
参考文献  44-50
附录  50

代谢工程改造酿酒酵母生产（S）-芳樟醇

内容摘要

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