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不同环境样品中副溶血性弧菌毒力基因表达差异研究及副溶血性弧菌活菌定量方法的建立

作　者: 李沁
导　师: 赵勇
学　校: 上海海洋大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 副溶血性弧菌内参基因毒力基因环境样品表达差异活菌定量
分类号: TS254.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性海洋细菌，是导致海产品性肠胃炎的主要病原菌。该菌广泛分布于全世界范围内的河口、海洋及近海环境中。近年来副溶血性弧菌的感染病例呈上升趋势，给水产品养殖和海产品消费带来极大的安全隐患。研究表明，副溶血性弧菌主要致病因子是溶血素类，它们是耐热直接溶血素(TDH)、耐热相关溶血素(TRH)以及不耐热溶血素(TLH)。另外，海虾中的副溶血弧菌检出率高达90％，严重威胁人体健康及水产品养殖业者。基因表达分析在生命科学的研究领域中变得日趋重要，而随之产生的反转录荧光定量PCR(qRT-PCR)技术已成为了以高通量和准确的基因表达定量为特点的基因表达分析的首选方法，可用于常规的病原微生物检测、单核苷酸多态性分析以及基因表达分析。目前，针对副溶血性弧菌毒力基因表达已经开展了初步的研究，但这些研究主要都是基于副溶血性弧菌的实验室纯培养条件以及单一的物理化学因素影响下的基因表达变化，存在一定的局限性。相关弧菌基因表达研究中发现，病原菌生存的真实环境对于研究其基因表达情况是十分重要的，在研究其毒力因子表达情况时，应尽量接近其生存的真实环境。另外选用表达稳定的基因作为校正内参对于完整的基因表达评价体系的建立是十分必要的。国内外针对内参基因的筛选已经有了大量的报道，但是多局限于植物和动物，而在致病微生物毒力基因表达方面的相关研究中对内参基因筛选的关注较少。因此，本研究从副溶血性弧菌广泛分布的水体环境出发，以虾样品中、海水样品中、过滤海水样品以及纯培养条件下的副溶血性弧菌为研究材料，先针对实验材料以及处理条件的不同筛选出表达稳定的管家基因作为表达分析的内参基因。后续采用qRT-PCR技术，对不同菌株以及不同环境条件处理后副溶血性弧菌tdh、trh和tlh基因的表达差异进行分析，希望为进一步揭示环境因子对毒力基因表达调控的机制及其不同毒力基因的环境适应性的相关研究打下基础。近年来，随着分子生物学检测技术的不断发展，已建立起许多基于荧光定量PCR的海产品中副溶血性弧菌的检测方法，这些方法凭借其特异性好，灵敏度高且耗时短等优点已得到了较广泛的应用。目前这些荧光定量PCR的检测技术大多基于DNA样品，但由于无法从DNA水平区分出检测样品中的死细胞、活细胞以及不可培养细胞，这样会使我们过高或错误的估计样品所存在的风险。随之产生的反转录荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，采用mRNA模板来取代DNA模板，可很大程度上降低活菌检测中的假阳性结果出现的概率，得到更准确可靠的检测结果。所以，本研究建立了一种基于RNA技术的副溶血性弧菌的活菌检测方法。实验结果表明：1、目前针对于食品样品中微生物总RNA的提取尚无一个成熟的方法，是后续相关分析的一大难点。因此我们首先对虾样品中副溶血性弧菌总RNA提取条件进行了优化，设置了两种细胞恢复溶液：0.85%生理盐水和0.1%蛋白胨溶液，以及两种均质方法，均质器匀浆和晃动均质，恢复溶液和均质方法亮亮组合进行提取效果的对比。结果显示晃动均质以及0.85%生理盐水组合提取的方法，能够从虾样品中提取得到较高纯度和完整性的副溶血性弧菌总RNA，可供后续基因表达分析实验使用。2、采用geNorm软件计算并分析了相关文献中已发表的4种副溶血性弧菌管家基因的表达稳定性，表达稳定性排列顺序为pvuA>pvsA>GAPDH>rpoS，再经过最优内参基因数目评价，确定了以pvuA和pvsA两个基因的几何平均值作为参照可更为准确地校正目的基因的表达。结果证明pvuA和pvsA基因可作为环境样品中副溶血性弧菌毒力基因表达变化研究的内参基因。3、采用qRT-PCR方法对5株菌在不同温度的海水、过滤海水及虾样品中毒力基因的表达变化情况进行了分析，结果初步显示来源于不同菌株的毒力基因对环境条件的适应能力存在差异。不同菌株的trh及tlh基因显示出了一定的低温高表达的特点；其次tdh基因表达的温度依赖性不显著，但QD菌株的tdh基因显示出了较高的饥饿耐受能力；另外携带有tdh及trh毒力基因菌株的tlh基因表达量与仅携带tlh基因菌株的tlh基因表达量之间存在较大的差异，由此推测tdh及trh基因的存在对tlh基因的表达量有一定的影响。4、本研究首次建立了一种基于RNA技术的虾中副溶血性弧菌的活菌定量方法。该方法免去了传统分离定量方法的增菌和培养过程，可在5小时之内完成整个实验，而且弥补了DNA定量方法的不足，排除了死细胞的干扰，能够准确对虾样品中活的副溶血性弧菌进行定量，反映出样品的真实致病风险。设计得到的tlh基因的引物特异性较高，RNA标准品以及标准曲线线性关系良好，方法检测限可达到58cfu/g样品，可用于实际样品的检测。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
目录  9-11
第一章绪论  11-20
  1.1 副溶血性弧菌的生物学特性  11-14
    1.1.1 副溶血性弧菌分布情况  11
    1.1.2 副溶血性弧菌毒力因子  11-14
  1.2 水产品中副溶血性弧菌检测方法  14-17
    1.2.1 传统分离培养法检测副溶血性弧菌  15-16
    1.2.2 基于 PCR 和杂交技术的分子生物学检测方法  16-17
  1.3 基因表达分析方法和技术进展  17-19
    1.3.1 Northern 印迹法  18
    1.3.2 核糖核酸酶保护试验  18
    1.3.3 实时荧光定量 PCR  18-19
  1.4 本研究的主要内容与意义  19
    1.4.1 研究内容  19
  1.5 研究目的和意义  19-20
第二章不同环境样品中副溶血性弧菌毒力基因表达变化研究  20-37
  2.1 引言  20-22
  2.2 材料与方法  22-26
    2.2.1 材料、试剂及设备  22
    2.2.2 菌种的活化与鉴定  22-23
    2.2.3 虾样品中副溶血性弧菌总 RNA 提取条件的优化  23
    2.2.4 RNA 提取质量检测及反转录  23-24
    2.2.5 不同环境样品中副溶血性弧菌毒力基因表达时内参基因的筛选  24-25
    2.2.6 海水、过滤海水及虾样品的菌株处理培养  25-26
  2.3 结果与分析  26-35
    2.3.1 不同方法提取的虾样品中副溶血性弧菌总 RNA 提取质量比较  26
    2.3.2 毒力基因表达变化研究中最优内参基因的确定  26-30
    2.3.3 不同环境样品中副溶血性弧菌毒力基因表达差异分析  30-35
  2.4 讨论  35
  2.5 本章小结  35-37
第三章水产品中副溶血性弧菌活菌定量方法的建立  37-44
  3.1 引言  37-38
  3.2 材料与方法  38-40
    3.2.1 菌种活化及样品制备  38
    3.2.2 RNA 标准品的构建及标准曲线的建立  38
    3.2.3 方法特异性和检测灵敏度实验  38-39
    3.2.4 模拟虾样品制备  39-40
  3.3 结果与分析  40-43
    3.3.1 RNA 标准品质量检测以及标准曲线分析  40-42
    3.3.2 方法特异性和检测灵敏度分析  42
    3.3.3 模拟样品传统检测方法、DNA 及 RNA 定量结果的比较分析  42-43
  3.4 讨论  43
  3.5 本章小结  43-44
第四章全文总结与展望  44-45
参考文献  45-51
本论文创新点  51-52
致谢  52

不同环境样品中副溶血性弧菌毒力基因表达差异研究及副溶血性弧菌活菌定量方法的建立

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