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蛭弧菌的分离、鉴定及对肠道致病菌噬菌特性的研究

作　者: 吕茉
导　师: 韩剑众
学　校: 浙江工商大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 蛭弧菌噬菌蛭弧菌属肠道致病菌噬菌特性副溶血性弧菌
分类号: R155.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

近年来,尽管食品安全问题集中在诸如农兽药残留超标、非法添加化学原料、添加剂的滥用以及随着生活水平提高带来的营养过剩等方面,但食源性疾病仍然是全球食品安全的主要问题。食源性疾病暴发又称食物中毒,其中66%以上的食物中毒为细菌性致病所致。国内外由于食物链中病原细菌污染及其造成的食源性疾病屡见不鲜。抗生素的出现对人类健康和生命保护起到了关键作用,但是大量不合理的使用抗生素使得细菌耐药性日趋严重,而细菌耐药性也助推了食源性细菌疾病的流行。与食品有直接和间接关系的致病性微生物都可能污染食品,但有检验意义的是能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物,常见的有：沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、志贺氏菌、禽流感病毒、黄曲霉菌及病毒、口蹄疫病毒等。我国对食品中的一些致病微生物的指标定义不得检出,而对另一些则有限量指标。因此,必须加强对这些主要的致病微生物的研究和防控工作。天然、无残留的灭菌方法是食品生产、加工、消费等各个环节的迫切需求。本文分别从浙江宁海海水、海泥中分离鉴定蛭弧菌,比较不同蛭弧菌株对肠道致病菌的裂解能力差异。并对所分离的菌株进行电镜形态观测,进行16S rDNA鉴定分析,通过比较分析噬菌斑大小以及蛭弧菌与宿主菌共培养的生长曲线变化,研究其噬菌特性,以期为蛭弧菌对食源性细菌进行防控的应用提供相关基础研究。本研究的主要内容和结果如下：株都属于噬菌蛭弧菌属(Bacteriovorax spp.)。对所分离到的6株菌进行负染,并在透射电镜下观察其大小和形态,蛭弧菌菌体短小,呈弧状、杆状,有一端生波浪状的鞭毛。利用灭菌海水作为保护液时,4℃冰箱中保存的所有菌株在91天时仍可以出斑,表明蛭弧菌此时仍有噬菌活性,蛭弧菌在4℃灭菌海水中至少可存活91天；而室温摇床中保存的蛭弧菌株的复苏情况有所差异,Bs2至少可存活49天,Bs5、Bs7、Bm1、Bm7至少可存活63天,Bm6至少可存活56天。利用生理盐水作为保护液时,4℃冰箱保存的所有菌株在91天时仍可以出斑,表明蛭弧菌在4℃生理盐水中至少可存活91天；在室温摇床中,Bs7和Bm7至少可以存活49天,而Bs2、Bs5、Bm1、Bm6的复苏能力相对较弱,至少可存活28天。利用加宿主菌的灭菌海水作为保护液时,4℃冰箱保存的所有蛭弧菌株,在7天时都不能形成噬菌斑,表明蛭弧菌在4℃加宿主菌的灭菌海水中7天即可失去活性；而在室温摇床环境下,除了Bs7和Bm7至少可存活21天外,其余菌株只能存活7天。利用加宿主菌的生理盐水作为保护液时,4℃冰箱保存的Bs2、Bs5、Bm1、Bm6至少可存活14天,而Bs7和Bm7在7天时即无噬菌斑检出；在室温摇床环境下,大部分菌株至少可以存活28天,其中Bs7和Bm7至少可存活14天。三、蛭弧菌对肠道致病菌的噬菌特性Bs2、Bs5、Bml和Bm7分别在72h时达到各自裂解率的峰值,裂解率分别为43.56%、71.28%、67.66%、95.81%；Bs7和Bm6分别在48 h、96h时达到各自裂解率的峰值,裂解率分别为98.70%和74.69%。另外,Bs2、Bs5、Bm1和Bm7的噬菌斑数量(PFU/mL)对应的在72 h时达到各自的峰值,分别为770、507、1064、240；Bs7和Bm6分别在48 h、96h时达到峰值,噬菌斑数量(PFU/mL)分别为279和588。海洋蛭弧菌对不同宿主菌的裂解能力有差异,其中,Bs7和Bmm7对同样来自海洋环境的副溶血性弧菌的裂解能力最强,裂解率都在95%以上,其次为Bm6对奇异变形杆菌的裂解率74.69%,而对陆生环境的其他宿主菌的裂解能力就相对较弱。不同来源的蛭弧菌株对同种宿主菌的裂解能力也不同,海水中的蛭弧菌可以裂解福氏志贺氏菌和侵袭性大肠埃希氏菌,而海泥中的蛭弧菌对这两种宿主菌无感染力,但是可以裂解鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌。蛭弧菌在裂解宿主菌的过程中,并不能将宿主菌完全消灭,只能将其数量控制在一定的范围内,而且有时间的限制。随着蛭弧菌裂解能力的强弱变化,蛭弧菌噬菌斑的数量也有着对应的增减变化。四、蛭弧菌对食源性细菌的防控用蛭弧菌喷洒的猪、鱼肉样品组的菌落总数、大肠菌群和pH值的上升趋势都比没有喷洒蛭弧菌的空白组要缓慢。其中蛭弧菌对猪肉在72 h内菌落总数的平均裂解率为51.55%,对鱼肉在72 h内菌落总数平均裂解率为62.08%。猪肉大肠菌群的平均裂解率约4.03%,鱼肉大肠菌群的平均裂解率为8.88%。猪、鱼肉各自样品和空白的挥发性盐基氮的变化趋势相差不多,TVBN值一直处于上升状态。12h猪肉和鱼肉中挥发性盐基氮的含量都明显超过了我国规定的对生鲜肉类的TVBN的可接受限15mgN/100g。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-16
第1章前言  16-30
  1.1 蛭弧菌及相关研究  16-28
    1.1.1 蛭弧菌的分类  16-17
    1.1.2 蛭弧菌的生活史及噬菌机制  17-20
    1.1.3 蛭弧菌的生态分布及其噬菌特性  20-23
    1.1.4 蛭弧菌在不利环境中的生存方式  23
    1.1.5 蛭弧菌形态研究方法  23-26
    1.1.6 蛭弧菌保存方法的研究  26-27
    1.1.7 蛭弧菌的应用研究  27-28
  1.2 本研究的意义  28-30
    1.2.1 背景及意义  28-29
    1.2.2 主要研究内容  29-30
第2章海水和海泥蛭弧菌的分离纯化  30-46
  2.1 预备实验  30-34
    2.1.1 材料和方法  30-32
    2.1.2 结果与分析  32-34
    2.1.3 结论  34
  2.2 实验材料  34
  2.3 实验方法  34-36
    2.3.1 宿主菌标准曲线的绘制  34-35
    2.3.2 宿主菌生长曲线的绘制  35-36
    2.3.3 宿主菌细胞培养和制备  36
    2.3.4 宿主菌添加量的优化  36
    2.3.5 蛭弧菌的分离纯化  36
  2.4 结果与分析  36-44
    2.4.1 宿主菌吸光值(OD)与菌落数(CFU)的标准曲线  36-38
    2.4.2 宿主菌生长曲线  38-39
    2.4.3 宿主菌添加量的优化  39-41
    2.4.4 分离结果  41-42
    2.4.5 不同蛭弧菌菌株噬菌斑的大小及数量  42-44
  2.5 讨论  44-46
    2.5.1 宿主菌的选择  44
    2.5.2 蛭弧菌的不同分型  44-45
    2.5.3 海洋环境蛭弧菌的数量  45-46
第3章海水和海泥蛭弧菌的鉴定和保存  46-59
  3.1 实验材料  46-47
    3.1.1 样品  46
    3.1.2 菌株  46
    3.1.3 主要试剂  46
    3.1.4 海水和培养基  46-47
    3.1.5 主要溶液  47
    3.1.6 主要仪器  47
    3.1.7 引物合成  47
  3.2 实验方法  47-50
    3.2.1 蛭弧菌基因组DNA提取及PCR鉴定  47-49
    3.2.2 透射电镜观测  49
    3.2.3 蛭弧菌菌株的短期保存  49-50
  3.3 结果与分析  50-57
    3.3.1 PCR鉴定结果  50-52
    3.3.2 电镜鉴定  52
    3.3.3 蛭弧菌的短期保存  52-57
  3.4 讨论  57-59
    3.4.1 PCR条件的摸索  57
    3.4.2 蛭弧菌的保存  57-59
第4章海洋蛭弧菌对肠道致病菌噬菌特性的研究  59-68
  4.1 实验材料  59
  4.2 实验方法  59-60
    4.2.1 宿主菌标准曲线的绘制  59
    4.2.2 宿主菌细胞培养和制备  59
    4.2.3 蛭弧菌对肠道致病菌噬菌能力的测定  59-60
  4.3 结果与分析  60-66
    4.3.1 蛭弧菌对肠道致病菌的噬菌能力  60-62
    4.3.2 噬菌斑大小、数量与宿主裂解率的关系  62
    4.3.3 蛭弧菌与宿主菌共培养的生长曲线  62-65
    4.3.4 蛭弧菌数量的变化趋势  65-66
  4.4 讨论  66-68
    4.4.1 不同环境蛭弧菌对宿主菌的寄生性比较  66
    4.4.2 蛭弧菌对不同肠道致病菌的裂解能力  66-67
    4.4.3 噬菌斑数量、大小与蛭弧菌裂解能力的关系  67-68
第5章蛭弧菌对食源性细菌的防控  68-79
  5.1 实验材料  68-69
    5.1.1 样品  68
    5.1.2 蛭弧菌混合液配制  68
    5.1.3 设备和材料  68
    5.1.4 培养基和试剂  68-69
  5.2 实验方法  69-71
    5.2.1 菌落总数的测定  70
    5.2.2 大肠菌群数的测定  70
    5.2.3 pH值的测定  70
    5.2.4 挥发性盐基氮的测定  70-71
  5.3 结果与分析  71-77
    5.3.1 菌落总数  71
    5.3.2 大肠菌群数  71-73
    5.3.3 pH值  73-74
    5.3.4 挥发性盐基氮  74-77
  5.4 讨论  77-79
    5.4.1 菌落总数  77-78
    5.4.2 大肠菌群  78
    5.4.3 挥发性盐基氮  78-79
第6章总结和展望  79-80
参考文献  80-85
致谢  85-86
硕士期间发表文章  86-87

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