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中间水分体系中β-乳球蛋白糖基化的研究

作　者: 陈颖佳
导　师: 周鹏
学　校: 江南大学
专　业: 食品科学
关键词: β-乳球蛋白还原糖糖基化位点质谱
分类号: TS201.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

中间水分食品因其良好的功能性和营养性受到广大消费者的欢迎,然而因为其中通常含有蛋白质和还原糖,因此较易发生糖基化反应以及更高阶段的美拉德反应,从而影响食品的感官和营养特性。作为反应物,蛋白和还原糖的结构影响着糖基化反应。蛋白一级序列和高级结构的差异使得潜在糖基化位点的反应活性各不相同；还原糖结构的差异使其具有不同的糖基化反应活性。前期研究蛋白糖基化的方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳和邻苯二甲醛法等,这些方法不能够准确鉴定糖基化位点。采用液质联用结合酶解的方法可以准确地研究蛋白本身潜在糖基化位点的反应活性,也可以研究还原糖结构对蛋白糖基化的影响,从而为减缓甚至抑制糖基化反应提供理论依据。另外,还原糖糖基化修饰后的蛋白在高级结构上可能有所变化,而还原糖结构不同对蛋白高级结构的影响也不同,对糖基化蛋白结构的探讨有利于预测糖基化对食品营养及功能性质的影响。因此,本文建立了中间水分模型体系,采用液质联用和酶解结合液质联用的方法探讨β-乳球蛋白潜在糖基化位点的反应活性以及还原糖种类对β-乳球蛋白糖基化程度和位点的影响。在此基础上,采用圆二色谱法和差示扫描量热法初步探讨不同还原糖修饰对β-乳球蛋白二级结构和三级结构的影响。研究结果表明,p-乳球蛋白的16个潜在糖基化位点在中间水分体系中的糖基化反应活性存在差别。反应活性从高到低为：L1>K91>K47、77、100>K70、75、83、135>K8、14、60、69、101、138、141。在中间水分体系中,不同结构的还原糖对蛋白的糖基化程度和糖基化位点的选择性也不同。糖基化程度的研究表明,还原糖分子尺寸增大,带负电荷和还原端亲电性降低会减小β-乳球蛋白糖基化速率和糖基化程度；开环部分比例和脱氧不影响β-乳球蛋白糖基化程度。糖基化位点的研究表明,核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖能与L1、K8、47、70、75、77、83、91、100和135这10个潜在糖基化位点反应,麦芽糖能与除K75外的9个位点反应,麦芽三糖能与除K8、70和75外的7个位点反应,半乳糖醛酸能与除K77外的9个位点反应,而果糖能与除K8外的9个位点反应：表明分子尺寸,带负电荷和还原端亲电性会影响还原糖对糖基化位点的选择性。对糖基化p-乳球蛋白结构的研究表明,糖基化修饰不改变p-乳球蛋白的二级结构,但是能够改变β-乳球蛋白的高级结构。在9种还原糖及衍生物中,半乳糖醛酸糖基化修饰使得β-乳球蛋白的高级结构部分去折叠,另外8种糖的糖基化修饰轻微改变了β-乳球蛋白的空间结构,增加了β-乳球蛋白分子的刚性。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
1 引言  9-19
  1.1 中间水分食品简介  9-11
    1.1.1 中间水分食品中的主要蛋白质  9-10
    1.1.2 中间水分食品中的还原糖  10-11
    1.1.3 中间水分食品中的保湿剂/增塑剂  11
  1.2 糖基化反应简介  11-14
    1.2.1 糖基化反应定义  11-12
    1.2.2 糖基化反应的影响因素  12-14
      1.2.2.1 水分活度对糖基化反应的影响  12-13
      1.2.2.2 还原糖种类对糖基化反应的影响  13-14
  1.3 生物质谱简介  14-17
    1.3.1 ESI简介  15-16
    1.3.2 质谱简介  16-17
  1.4 本课题的立题背景、立题意义及主要研究内容  17-19
    1.4.1 立题背景及意义  17
    1.4.2 主要研究内容  17-19
2 实验材料与方法  19-24
  2.1 实验材料  19
  2.2 主要仪器  19
  2.3 实验方法  19-24
    2.3.1 样品制备  19-20
      2.3.1.1 中间水分食品模型体系制备  19-20
      2.3.1.2 简化模型的制备  20
    2.3.2 美拉德反应程度测定  20-21
    2.3.3 β-乳球蛋白分子量变化  21
    2.3.4 糖基化程度鉴定  21-22
    2.3.5 糖基化位点鉴定  22
    2.3.6 蛋白二级结构鉴定  22-23
    2.3.7 蛋白三级结构鉴定  23-24
      2.3.7.1 近紫外CD  23
      2.3.7.2 DSC  23-24
3 结果与讨论  24-55
  3.1 中间水分体系中β-乳球蛋白的糖基化反应  24-37
    3.1.1 β-乳球蛋白美拉德反应进程  24
    3.1.2 糖基化/美拉德反应对β-乳球蛋白分子量的影响  24-26
    3.1.3 β-乳球蛋白糖基化反应程度  26-31
    3.1.4 β-乳球蛋白糖基化反应位点  31-37
  3.2 还原糖结构对β-乳球蛋白糖基化的影响  37-48
    3.2.1 还原糖结构对β-乳球蛋白糖基化程度的影响  37-39
      3.2.1.1 还原糖结构对β-乳球蛋白糖基化反应起始阶段的影响  37-39
      3.2.1.2 还原糖结构对β-乳球蛋白糖基化反应平台阶段的影响  39
    3.2.2 还原糖在质谱中的碎片离子行为  39-46
    3.2.3 还原糖结构对糖基化位点的影响  46-48
  3.3 糖基化修饰对β-乳球蛋白结构的影响  48-55
    3.3.1 糖基化修饰对β-乳球蛋白二级结构的影响  49-50
    3.3.2 糖基化修饰对β-乳球蛋白三级结构的影响  50-55
4 结论与展望  55-57
  4.1 主要结论  55
  4.2 展望  55-57
致谢  57-58
参考文献  58-62
附录A：补充材料  62-75
附录B：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  75

中间水分体系中β-乳球蛋白糖基化的研究

内容摘要

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