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一株米曲霉所产蛋白酶酶解特性及其在调味品中的应用研究

作　者: 马俊阳
导　师: 诸葛斌
学　校: 江南大学
专　业: 微生物学
关键词: 蛋白酶酶解分离纯化酶学性质酶解特性
分类号: TS201.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

蛋白酶水解蛋白质中的肽键并生成氨基酸或小肽，其在食品及调味品中的运用可提升蛋白质的口感和营养价值。微生物是蛋白酶的主要来源，是国内外微生物酶的研究重点之一，由于食品安全日益受到全球人们的重视，因此，对于安全微生物所产蛋白酶的研究显得尤为重要。不同食品用安全蛋白酶的酶促特性研究对于蛋白酶食品业应用的深度开发具有重要意义。为获得安全的食品用蛋白酶生产菌株，以本研究中心保藏的3株米曲霉，3株黑曲霉和4株枯草芽孢杆菌为研究对象，筛选出适合食品及调味品用蛋白酶产生菌株3株。以鸡肉蛋白（CP）为底物，考察了这三个菌株所产粗酶液对CP的水解效果。通过比较发现水解度相同的情况下，米曲霉所产蛋白酶对CP的水解效果最好，小肽含量最高（31.74mg/mL），鲜味氨基酸总量最高（2.37mg/mL）。为进一步研究米曲霉所产蛋白酶的酶系，采用硫酸铵沉淀，DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析，Phenyl-Sepharose HP疏水层析和Superdex-G75/200凝胶层析相结合技术，对米曲霉胞外主要蛋白酶组分进行分离纯化，得到了两种不同的蛋白酶P1和P2，P1比活力达到2469.03U/mg，纯化倍数为6.33，回收率为10.61%；P2比活力达到1427.96U/mg，纯化倍数为3.67，回收率为1.06%，分子量分别约为37kDa（P1）和45kDa（P2）。蛋白酶P1和P2酶学性质研究表明，两者的酶学性质参数和作用基团存在异同。以酪蛋白为底物时，蛋白酶P1的Km=8.36g/L，Vm=12.95μg/(mL·min)，最适作用条件为pH8.0，45℃，pH5-10范围内稳定性良好；蛋白酶P2的Km=4.11g/L，Vm=4.86μg/(mL·min)，最适作用条件为pH7.0，45℃，pH5-8内其酶活均保持在85%以上。两者均在低于40℃的条件下有很好的稳定性，温度超过60℃则极不稳定。以牛胰岛素B链为模型底物考察蛋白酶P1和P2的肽键选择性，结果表明蛋白酶P1对-Cys-Gly-和-Phe-Tyr-肽键有非常强的切割能力，蛋白酶P2则对-Gly-Ser-和-Gly-Phe-肽键有非常强的选择性。以大豆分离蛋白（SPI）和CP为底物，考察蛋白酶P1和P2分别对其的水解效果。结果表明，SPI经P1和P2分别酶解后，分子量大于10kDa的多肽所占的比例由83.86%分别降至9.51%和7.90%，CP经P1和P2分别酶解后，由58.66%分别降至0.029%和0.48%。酶解后，游离氨基酸总量都有不同程度的增加，以鲜味氨基酸（Asp，Glu，Gly，Ala）总量占总氨基酸的比例为指标时，P1酶解SPI和CP为40.9%和63.09%，P2为35.26%和25.1%，并能在一定程度上降低蛋白水解液的苦味。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-8
第一章绪论  8-13
  1.1 蛋白酶概况  8
    1.1.1 蛋白酶概述  8
    1.1.2 蛋白酶分类  8
  1.2 微生物蛋白酶在食品上的安全性和应用  8-9
  1.3 产蛋白酶安全菌株研究概况  9
  1.4 食品用蛋白酶的酶促特性  9-12
  1.5 本课题的研究意义及主要研究内容  12-13
    1.5.1 研究意义  12
    1.5.2 研究内容  12-13
第二章材料与方法  13-20
  2.1 材料  13-14
    2.1.1 菌株及原料  13
    2.1.2 培养基  13
    2.1.3 主要试剂  13-14
    2.1.4 主要仪器  14
  2.2 方法  14-20
    2.2.1 培养方法  14
    2.2.2 分析方法  14-16
    2.2.3 蛋白酶纯化方法  16
    2.2.4 蛋白酶催化性质及酶解特性的研究方法  16-20
第三章结果与讨论  20-39
  3.1 产蛋白酶微生物的获得与比较  20-25
    3.1.1 产蛋白酶菌株的筛选  20-21
    3.1.2 三种微生物所产蛋白酶的比较  21-25
  3.2 米曲霉蛋白酶主要组分的分离纯化  25-30
    3.2.1 米曲霉蛋白酶的初步提纯  25
    3.2.2 米曲霉蛋白酶的层析纯化  25-29
    3.2.3 两种米曲霉蛋白酶的分子量及酶谱  29-30
  3.3 两种米曲霉蛋白酶催化性质及酶解特性研究  30-39
    3.3.1 蛋白酶 P1 和 P2 温度及 pH 特性  30-31
    3.3.2 蛋白酶 P1 和 P2 的动力学特性  31-34
    3.3.3 金属离子对蛋白酶 P1 和 P2 酶活性的影响  34
    3.3.4 蛋白酶 P1 和 P2 的底物和肽键选择性  34-35
    3.3.5 蛋白酶 P1 和 P2 的应用效果比较  35-39
主要结论与展望  39-40
  主要结论  39
  展望  39-40
致谢  40-41
参考文献  41-44
附录1 作者在攻读硕士学位期间发表的论文  44-45
附录2 图谱  45-51

一株米曲霉所产蛋白酶酶解特性及其在调味品中的应用研究

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