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PeaT1诱导烟草系统获得抗病性及其作用机理的研究

作　者: 张微
导　师: 杨秀芬
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 烟草花叶病毒系统获得抗性实时荧光定量PCR 水杨酸信号传导途径木质素
分类号: S432.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

PeaT1是作者实验室从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离出的一种蛋白类激发子。前期研究证明,原核表达的PeaT1具有诱导植物提高抗病性的功能,为了探讨其作用机理,本文以烟草和TMV为研究系统,研究了PeaT1诱导烟草对烟草花叶病毒(TMV)的系统抗性,测定了烟草抗病防御酶活性以及防御物质的相对含量;用实时荧光定量PCR和RT-PCR技术研究了PeaT1诱导烟草后对TMV病毒粒子增殖的影响、PeaT1对TMV的体外钝化作用以及水杨酸信号传导途径中相关基因转录表达的变化,该研究丰富了蛋白激发子与植物互作理论,为进一步阐明PeaT1诱导植物抗病的作用机制提供了理论依据。1.获得了高效原核表达的PeaT1,纯化蛋白PeaT1可以诱导烟草对TMV侵染产生系统获得抗病性,表现为病毒侵染引起的系统症状减轻,与未诱导的植株比较,显症期推迟6 h左右,系统枯斑抑制率可达54.05%,枯斑大小抑制率可达31.3%。2.研究表明PeaT1诱导烟草产生的防卫反应对TMV病毒复制有抑制作用,但对TMV的体外钝化作用并不明显。PeaT1在诱导系统烟5 d后接种TMV,接种5 d后用半叶枯斑法检测枯斑三生烟(Nicotiana tabacum cv. Samsun-NN)叶片的病毒粒子浓度仅为清水对照的65.87%;实时荧光定量PCR法检测证明,诱导处理的烟草体内TMV-CP基因的蓄积量抑制率可达75.4%,这从另一个角度对半叶枯斑法的测定结果进行了验证;体外钝化试验研究表明PeaT1对TMV无明显的体外钝化作用。3. PeaT1诱导烟草后,木质素积累量增加,防御酶活性增强,系统获得抗性标记基因的转录表达增强。木质素含量在PeaT1处理枯斑三生烟幼苗5 d后开始明显升高并在6 d时达到峰值,是对照的4倍;多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)酶也均比对照增强,分别比对照提高了267.2 %和77.96 %。PR1a、PR1b基因转录增强且具有时序性转录的特点。4、水杨酸信号传导途径参与了PeaT1诱导烟草产生的系统获得抗病性。实时荧光定量PCR技术检测发现,PeaT1诱导烟草叶片后,系统获得抗病性标志基因PR1a上调23.71倍、PR1b上调19.95倍,水杨酸信号传导途径关键基因NPR1上调9.875倍,水杨酸合成关键酶基因PAL上调8.255倍,而乙烯茉莉酸途径标志基因PDF1.2转录水平并未提高;叶片内水杨酸含量提高,24 h后较对照提高3倍。5. PeaT1不能诱导转NahG基因的烟草提高抗病性,系统获得抗病性的标志基因也没有转录上调。进一步证明,PeaT1通过启动烟草的水杨酸信号传导途径,使烟草产生了抗病防卫反应。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-12
第一章引言  12-22
  1.1 激发子的种类及研究现状  12-15
    1.1.1 激发子的分类  12-14
    1.1.2 激发子诱导抗病性的特点  14-15
  1.2 激活蛋白（Activator）研究现状  15
  1.3 植物对病毒的抗病性及诱导抗病性  15-19
    1.3.1 植物对病毒的抗病性  15-16
    1.3.2 诱导抗病性  16-19
  1.4 系统获得抗病性的信号传导途径  19-20
    1.4.1 SA 介导的抗病信号传导途径  19
    1.4.2 茉莉酸和乙烯介导的抗病信号传导途径  19-20
    1.4.3 两条抗病信号传导途径的关系  20
  1.5 抗病毒物质对病毒的体外抑制作用  20-21
  1.6 本研究目的和意义  21-22
第二章 PeaT1 诱导烟草系统抗病性研究  22-28
  2.1 材料  22-23
    2.1.1 PeaT1 表达菌株和烟草幼苗的培养  22
    2.1.2 实验试剂和仪器  22-23
  2.2 试验方法  23-24
    2.2.1 PeaT1 的表达与纯化  23-24
    2.2.2 PeaT1 诱导烟草系统抗病性研究  24
  2.3 试验结果  24-27
    2.3.1 重组PeaT1 的表达与纯化  24-25
    2.3.2 PeaT1 诱导烟草TMV 抗性  25-27
  2.4 小结与讨论  27-28
第三章 PeaT1 诱导烟草对TMV 复制以及体外钝化的影响  28-35
  3.1 材料  28-29
    3.1.1 植物和毒源材料  28-29
    3.1.2 质粒材料  29
  3.2 方法  29-30
    3.2.1 半叶枯斑法检测PeaT1 诱导烟草对TMV 复制的影响  29
    3.2.2 TMV-CP 在寄主体内蓄积量的情况  29-30
    3.2.3 PeaT1 对TMV 的体外钝化情况  30
  3.3 结果与分析  30-33
    3.3.1 半叶枯斑法检测PeaT1 诱导烟草抗病性  30-31
    3.3.2 实时荧光PCR 绝对定量TMV-CP 在寄主体内的蓄积量  31-33
    3.3.3 PeaT1 对TMV 体外钝化作用  33
  3.4 小结与讨论  33-35
第四章 PeaT1 诱导烟草系统获得抗病性的生化机制  35-42
  4.1 材料  35-36
    4.1.1 供试植物  35
    4.1.2 供试试剂与仪器  35-36
  4.2 方法  36-38
    4.2.1 PeaT1 诱导后烟草叶片中抗病防御相关酶活性的变化  36
    4.2.2 激活蛋白PeaT1 诱导烟草后叶片中木质素含量的变化  36-37
    4.2.3 RT-PCR 检测PeaT1 诱导烟草后SAR 的标志基因PR1a 和 PR16 的表达情况  37-38
  4.3 试验结果  38-41
    4.3.1 PeaT1 诱导烟草对抗病防御相关酶活性的影响  38-39
    4.3.2 PeaT1 诱导后对烟草叶片内木质素含量的积累  39-40
    4.3.3 PeaT1 诱导对SAR 标志基因的转录的影响  40-41
  4.4 小结与讨论  41-42
第五章 PeaT1 诱导烟草系统抗病性信号传导途径的初探  42-52
  5.1 实时荧光定量PCR 检测烟草抗病相关基因的表达情况  43-45
    5.1.1 实验材料  43
    5.1.2 方法  43-45
  5.2 PeaT1 诱导烟草叶片对SA 含量的影响  45-46
    5.2.1 实验材料  45
    5.2.2 实验方法  45-46
  5.3 PeaT1 在转nahG 基因烟草系统抗病性研究  46-47
    5.3.1 材料  46
    5.3.2 方法  46-47
  5.4 实验结果  47-51
    5.4.1 RT-PCR 检验引物特异性  47
    5.4.2 荧光定量PCR 分析抗病相关基因转录水平  47-49
    5.4.3 PeaT1 诱导烟草叶片提高SA 含量  49-50
    5.4.4 PeaT1 在转nahG 基因烟草系统抗病性  50-51
  5.5 小结与讨论  51-52
第六章结论  52-53
参考文献  53-60
致谢  60-61
作者简介  61

PeaT1诱导烟草系统获得抗病性及其作用机理的研究

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