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枯草芽孢杆菌Tpb55抗菌蛋白Bst1的分离和基因克隆及其序列分析

作　者: 李佰乐
导　师: 孔凡玉
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 枯草芽孢杆菌Tpb55 烟草赤星病菌抗菌蛋白Bst1 基因克隆序列分析
分类号: S476.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究已从大田烟草叶片表面分离的一株植物生防细菌菌株——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Tpb55作为研究材料,对该菌的生防机理及生防物质做过初步研究,在分离纯化对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)具有较强拮抗活性的抗菌蛋白Bst1的基础上,对该抗菌蛋白进行了N端部分氨基酸序列测序,得到抗菌蛋白Bst1的前18个氨基酸序列后,通过网上NCBI的BLASTP程序搜索及其同源性比对,搜索到与该蛋白前18个氨基酸相似性极高的蛋白序列,并在此基础上找到该蛋白的编码保守序列,设计两端引物时,严格遵守密码子的兼并性,采用高保真的PCR技术克隆到了抗菌蛋白Bst1的编码基因,对其编码全序列进行了测序,并对该序列进行了同源性比对分析。Bst1抗菌蛋白编码基因的克隆对烟草抗病育种提供了有潜在应用价值的新的目的基因。通过离体抑菌试验活性检测及DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75(1.6cm×80cm)凝胶层析等分离方法,大量制备并纯化了抑菌蛋白Bst1,并通过SDS-PAGE电泳检测,检测结果表明得到单一条带,分子量大小约为47 kD。对Bst1蛋白的N端部分氨基酸测序结果显示,其N端前18个氨基酸序列为M-E-I-F-K-Y-M-E-T-Y-D-Y-E-Q-L-V-F-C-。以此序列为靶序列在网上通过BLAST程序对蛋白质数据库进行类似性检索,发现其与报道的来自枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因有很高的同源性,初步认为该蛋白为该菌的亮氨酸脱氢酶。因此,在已得到的前18个氨基酸序列及序列比对得到的C端的保守区序列的基础上设计并合成两端兼并引物,以枯草芽孢杆菌Tpb55的基因组DNA为模板,通过高保真的PCR技术扩增了该蛋白的编码序列,并克隆到pEASY-T1 Cloning Vector上,该段编码序列表明,其5’端54个核苷酸序列与N端前18个氨基酸序列完全吻合,序列全长1095bp,编码365个氨基酸。序列分析结果确与枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶家族基因有很高的同源性,证明该蛋白就是Tpb55菌株的亮氨酸脱氢酶,并对其结构进行了分析。本研究发现的亮氨酸脱氢酶具有抗菌活性,国内外均未见报道。该基因的克隆得到了新的烟草外源抗病基因,丰富了我国烟草的抗病育种基因库,为后续的烟草赤星病及真菌病害抗病育种大下了良好的研究基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-11
第一章综述  11-19
  1.1 烟草赤星病的概述  11-13
    1.1.1 烟草赤星病的症状  11
    1.1.2 病原学  11-12
    1.1.3 烟草赤星病抗病品种的选育及研究进展  12-13
  1.2 抗植物真菌病害基因工程的研究及应用  13-15
  1.3 抗植物真菌病害蛋白基因的研究和应用  15-18
    1.3.1 对致病真菌细胞壁起水解作用的蛋白酶基因  15-16
    1.3.2 蛋白合成干扰素基因  16
    1.3.3 小分子量抗真菌蛋白基因  16-17
    1.3.4 植物分泌的病程相关蛋白编码基因  17
    1.3.5 广谱抗真菌蛋白的基因  17
    1.3.6 功能还不明确的抗真菌蛋白  17-18
  1.4 菌株T_(PB)55 的研究背景及意义  18-19
第二章 BST1 抗菌蛋白的分离及N 末端部分氨基酸序列的测定分析  19-34
  2.1 材料与方法  19-26
    2.1.1 Bst1 抗菌蛋白的分离  19-21
      2.1.1.1 主要试剂  19-20
      2.1.1.2 缓冲液  20
      2.1.1.3 仪器  20
      2.1.1.4 生防菌株的来源和保存  20
      2.1.1.5 培养基的配置  20-21
    2.1.2 检测枯草芽孢杆菌Tpb55 对烟草赤星病菌的拮抗活性  21
    2.1.3 抗菌粗蛋白提取液的制备  21-22
    2.1.4 DEAE Sepharose 离子交换层析过程  22-23
    2.1.5 Sephadex G-75 分子交换层析  23
    2.1.6 抗菌蛋白Bst1 的抑制烟草赤星病菌活性检测  23
    2.1.7 Bst1 抑菌蛋白的纯度及其分子量测定  23-26
      2.1.7.1 主要试剂及缓冲液的制备如下  23-24
      2.1.7.2 Bst1 蛋白上样样品制备  24
      2.1.7.3 SDS 电泳检测蛋白的分子量及纯度  24
      2.1.7.4 电泳胶的银染过程如下  24-26
    2.1.8 Bst1 抗菌蛋白N 末端前18 个氨基酸序列测定  26
      2.1.8.1 试剂与仪器  26
      2.1.8.2 抗菌蛋白Bst1 的N 末端前18 个氨基酸序列测定  26
  2.2 结果与分析  26-34
    2.2.1 Bst1 抗菌蛋白的分离  26-30
    2.2.2 枯草芽孢杆菌Tpb55 抗菌蛋白Bst1N 末端前18 个氨基酸序列的测定  30-34
第三章抑菌蛋白BST1 编码基因的克隆及序列分析  34-45
  3.1 材料与方法  34-35
    3.1.1 枯草芽孢杆菌Tpb55 基因组DNA 的提取与制备  34-35
      3.1.1.1 供体菌株  34
      3.1.1.2 试剂及主要仪器  34
      3.1.1.3 Tpb55 菌株的培养  34
      3.1.1.4 Tpb55 基因组DNA 的提取  34-35
  3.2 抑菌蛋白BST1 编码基因的PCR 扩增  35-39
    3.2.1 主要试剂及仪器  35
    3.2.2 引物的设计与合成  35
    3.2.3 PCR 扩增  35-36
    3.2.4 PCR 产物的回收  36-37
    3.2.5 PCR 产物的克隆  37-38
      3.2.5.1 菌株和质粒  37
      3.2.5.2 PCR 纯化回收产物与pEASY-T1 Cloning Vector 连接  37-38
      3.2.5.3 连接产物转化大肠杆菌Tra1151-T1 感受态细胞  38
    3.2.6 阳性克隆的筛选与鉴定  38-39
    3.2.7 序列同源性比较  39
  3.3 结果与分析  39-45
    3.3.1 枯草芽孢杆菌Tpb55 基因组DNA 的提取  39-40
    3.3.2 抑菌蛋白Bst1 编码基因的PCR 扩增  40
    3.3.3 PCR 产物的克隆与鉴定  40-41
    3.3.4 核苷酸序列测定  41-42
    3.3.5 序列分析  42-45
第四章讨论与建议  45-48
参考文献  48-53
致谢  53-54
作者简历  54

枯草芽孢杆菌Tpb55抗菌蛋白Bst1的分离和基因克隆及其序列分析

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