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分泌表达葡萄白藜芦醇合成酶工程菌的构建及发酵条件优化

作　者: 董良媛
导　师: 刘晔
学　校:
专　业: 食品工程
关键词: 白藜芦醇 白藜芦醇合成酶 葡萄 基因工程
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


白藜芦醇（Resveratrol，Res）是一种植物抗毒素（phytoalexin），属非黄酮类多酚化合物，广泛存在于多种植物中，其中中药虎杖和葡萄中的含量尤为丰富。近年来对白藜芦醇生理活性的研究表明：白藜芦醇对于人的身体健康具有很多的药理活性和保健功能，如抗肿瘤、抗炎、抗衰老、抗菌、免疫护肝、治疗心血管疾病、保护线粒体、保护神经作用等。目前，白藜芦醇的制取方法主要是天然植物提取法、植物细胞培养法和化学合成法，但他们都有各自的缺点，因此，利用基因工程的方法构建能够生产白藜芦醇的工程菌是提高植物中Res含量的可行途径之一。本研究首先通过NCBI查询到葡萄中白藜芦醇合成酶基因的编码序列（ID:AB046375），并根据基因序列设计特异性引物，以葡萄cDNA作为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)技术特异性扩增出白藜芦醇合成酶基因，该基因序列大小为1179bp。将其克隆到大肠杆菌表达载体pET22b上，转入到大肠杆菌感受态DH5a中，获得克隆菌株DH5a-pET22b-RS，测序验证并保藏菌株。将质粒pET22b-RS转入大肠杆菌BL21（DE3）中，获得工程菌BL21-pET22b-RS，经IPTG诱导后，用SDS-PAGE电泳检测到42.9KDa重组蛋白，与报道相同。接着对可用于发酵生产白藜芦醇的BL21-pET22b-RS重组菌株的发酵条件进行了研究。通过HPLC（高效液相色谱）检测白藜芦醇的方法，检测添加底物对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A经过发酵培养后得到的白藜芦醇产量，并通过对发酵条件的优化研究了一些重要因素对发酵的影响，确定了较为适合的白藜芦醇生产条件。结果表明：当种龄为12h，接种量为5%，诱导剂的浓度为0.1mM，培养温度为30℃，pH为6.5，选用的培养基为LB液体培养基，且甘油作为碳源，整个发酵过程的时间为24h，获得白藜芦醇的产量最高，可达25.21mg/L。本研究成功的构建了带有白藜芦醇合成酶基因的工程菌BL21-pET22b-RS，并且优化了其发酵条件，为未来实现利用微生物生产白藜芦醇工业化、产业化打下了基础。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-11
第1章 绪论  11-25
  1.1 白藜芦醇的概况  11-12
    1.1.1 白藜芦醇的简介  11
    1.1.2 白藜芦醇的分布  11-12
  1.2 白藜芦醇的药理作用  12-14
    1.2.1 抗菌作用  12
    1.2.2 抗肿瘤作用  12-13
    1.2.3 防治心血管疾病的作用  13-14
    1.2.4 保护肝脏的作用  14
  1.3 白藜芦醇的制取方法  14-18
    1.3.1 从天然植物中提取  14-15
    1.3.2 化学合成  15-16
    1.3.3 植物细胞培养技术  16-17
    1.3.4 芪合酶转基因技术  17-18
  1.4 白藜芦醇合成酶的概况  18-22
    1.4.1 芪合酶的介绍  18
    1.4.2 白藜芦醇合成酶研究进展  18-22
  1.5 大肠杆菌表达系统的概况  22
  1.6 白藜芦醇的分析测定  22-24
    1.6.1 定性检测方法  22-23
    1.6.2 定量检测方法  23-24
  1.7 本课题研究的目的和意义  24-25
第2章 材料与方法  25-35
  2.1 材料  25-27
    2.1.1 植物材料  25
    2.1.2 菌种和质粒  25
    2.1.3 酶  25
    2.1.4 仪器设备  25-26
    2.1.5 实验试剂及试剂盒  26-27
    2.1.6 培养基  27
  2.2 方法  27-35
    2.2.1 葡萄总 RNA 的提取方法  27-28
    2.2.2 cDNA 文库的构建  28
    2.2.3 PCR（聚合酶链式反应）  28-29
    2.2.4 DNA 的快速电泳检测  29
    2.2.5 DNA 的纯化回收  29-30
    2.2.6 DNA 的限制性酶切  30
    2.2.7 质粒与目的片段的连接  30-31
    2.2.8 大肠杆菌感受态的制备  31
    2.2.9 质粒转化大肠杆菌感受态（DH5α和 BL21）  31
    2.2.10 菌落 PCR  31-32
    2.2.11 大肠杆菌的质粒提取  32
    2.2.12 目的蛋白的诱导表达  32-34
    2.2.13 HPLC 法测定白藜芦醇的含量  34-35
第3章 结果与讨论  35-49
  3.1 pET22b 表达载体构建策略  35-36
    3.1.1 分泌表达的设计思路  35
    3.1.2 酶切位点的选择  35
    3.1.3 在 pET22b 表达质粒中插入 RS  35-36
  3.2 构建工程菌 BL21-pET22b-RS  36-41
    3.2.1 设计克隆白藜芦醇合成酶基因的特异性引物  36-37
    3.2.2 PCR 克隆 RS 基因  37
    3.2.3 pET22b 与 RS 的双酶切  37-38
    3.2.4 pET22b 与 RS 的连接  38
    3.2.5 pET22b-RS 转化克隆菌株大肠杆菌 DH5α  38-41
    3.2.6 pET22b-RS 转化表达菌株大肠杆菌 BL21  41
  3.3 对工程菌 BL21-pET22b-RS 中 RS 基因的诱导表达  41-49
    3.3.1 判断是否有白藜芦醇合成酶的表达  41-42
    3.3.2 判断诱导 RS 表达 IPTG 的最佳诱导浓度  42-43
    3.3.3 产白藜芦醇工程菌发酵条件的优化  43-49
第4章 总结与展望  49-51
参考文献  51-60
致谢  60

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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