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哈茨木霉菌发酵液中Peptaibols类抗菌肽的分离纯化、鉴定及活性研究

作　者: 潘顺
导　师: 王为民
学　校:
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 哈茨木霉菌 Peptaibols 分离纯化 抑菌活性
分类号: TQ465
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


Peptaibols是指一类主要由木霉属(Trichoderma spp.)真菌产生的富含α-氨基异丁酸Aib、具烷基化的N-末端和羟基化的C-末端、具α-螺旋线性结构的特殊抗菌肽,可与膜系统结合形成跨膜离子通道破坏膜系统而具有广泛的抗菌活性,本研究拟对哈茨木霉菌次生代谢产物中peptaibols类抗菌肽进行分离和结构鉴定,为进一步了解哈茨木霉菌的拮抗机理及扩大其应用奠定基础。本试验对哈茨木霉菌Trichoderma harzianum CGMCC No.1780进行液体发酵,以对立枯丝核菌菌丝生长的抑制作用作活性追踪,以4,4’-(对二甲氨基)二苯基甲烷(TDM)特异性显色法做快速定性鉴定,采用XAD-2大孔吸附树脂、LH-20葡聚糖凝胶及高效薄层层析硅胶板及反相高效液相色谱对发酵液中peptaibols类抗菌肽进行分离纯化,利用LC-ESI-MS/MS对peptaibols进行结构鉴定；测定了制备的peptaibols样品对多种植物病原真菌菌丝生长、菌核形成及萌发、孢子萌发、菌丝形态、细胞壁完整性及膜系统通透性的影响,以及与木霉素(Trichodermin)的联合作用时对病原真菌菌丝生长影响。获得以下结果：(1)从哈茨木霉菌发酵液中分离鉴定出Alamethicin F-50、Alamethicin Ⅱ、Atroviridin B、Atroviridin C、Stilboflavins B1、Stilboflavins B2、 Stilboflavins B3、Stilboflavins B4、Trichokindin Ia、Trichokindin Ⅱa、 Trichokindin Ⅲa、Trichokindin_Ⅳ、Trichocompactins Ⅱa、Trichocompactins Ⅲa、Trichocompactins Ⅳ、peptaibol FC1、peptaibol FC2、peptaibol FC3、peptaibol FC4、peptaibol FC5等20种peptaibols,其中peptaibol FC1、 peptaibol FC2、peptaibol FC3、peptaibol FC4、peptaibol FC5等5种属于新发现的peptaibols,利用反相高效液相色谱对Alamethicin F-50、 Alamethicin Ⅱ、Atroviridin B、Atroviridin C、Peptaibol FC1-5等9种peptaibols进行了纯化制备。(2) Peptaibols Alamethicin F-50、Alamethicin Ⅱ、Atroviridin B、 Atroviridin C可显著抑制水稻纹枯病菌(T.cucmeris)、黄瓜立枯病菌(R.Solani)、水稻稻瘟病菌(M.oryzae)、黄瓜枯萎病菌(F.cucumerinum)、西瓜枯萎病菌(F.niveum)等病原真菌菌丝生长,EC5o分别为3.00、3.51、3.39.3.89μg·ml-1,1.32.1.78.1.53.1.91μg·ml’1,2.54.3.20.2.75.3.30μg·ml-1,8.22.10.0.8.71.10.79μg·ml-1,17.7.20.89.18.6.22.5μg·ml-1;(3) Peptaibols Alamethicin F-50、Alamethicin Ⅱ、Atroviridin B. Atroviridin C可抑制黄瓜枯萎病菌(F.cucumerinum)、西瓜枯萎病菌(F.niveum).水稻稻瘟病菌(M.oryzae)等病原真菌孢子的萌发,EC50分别为5.74.6.75.6.10.6.55μg·ml-1,12.9.16.8.13.5.18.5μg·ml-1,24.3.28.7.26.5.30.2μg·ml-1;(4) Peptaibols FC可破坏水稻纹枯病菌(T.cucmeris)细胞壁完整性及增大膜系统通透性,Peptaibols Alamethicin F-50及Peptaibols FC对病原真菌菌丝形态具有致畸作用,Peptaibols FC对水稻纹枯病菌(T.cucmeris)菌核形成具有显著的抑制效果；(5) Alamethicin F-50与木霉素Trichodermin质量比例1：4联合时对水稻纹枯菌(T. cucmeris)具有协同抑制作用,毒力EC50为1.03μg·ml-1;质量比例1：4联合时对水稻稻瘟菌(M.oryzae)菌丝生长具有协同抑制作用,毒力EC50为4.67μg·ml-1;

全文目录


致谢  6-7
摘要  7-9
Abstract  9-14
图清单  14-16
表清单  16-17
1 前言  17-34
  1.1 Peptaibols抗菌肽研究进展  18-27
    1.1.1 Peptaibols抗菌肽的结构特征  18-20
    1.2.2 Peptaibols抗菌肽的发酵生产  20
    1.1.3 Peptaibols抗菌肽的分离纯化  20-22
    1.1.4 Peptaibols抗菌肽的鉴定  22-25
    1.1.5 Peptaibols抗菌肽的活性  25
    1.1.6 Peptaibols抗菌肽的作用机制  25-27
  1.2 哈茨木霉菌具有抗生活性的其它次生代谢产物  27-33
    1.2.1 单端孢霉烯毒素类  27-28
    1.2.2 吡喃酮类  28
    1.2.3 吡喃类  28-29
    1.2.4 杂环氮类  29
    1.2.5 环戊烯酮类  29-30
    1.2.6 聚酮类  30
    1.2.7 丁烯酸内酯类  30
    1.2.8 异氰类  30-31
    1.2.9 二酮哌嗪类  31
    1.2.10 菖蒲烷类  31
    1.2.11 Harzialactones  31-32
    1.2.12 Setin类  32
    1.2.13 Cyclonerodiol类  32
    1.2.14 Miscelanea类  32-33
  1.3 立题依据  33-34
2 哈茨木霉菌发酵液中Peptaibols类抗菌肽的分离纯化及鉴定  34-61
  2.1 材料与方法  34-41
    2.1.1 试验菌株  34
    2.1.2. 试剂与仪器  34-35
    2.1.3 Peptaibols薄层层析板TDM特异性显色方法  35-36
    2.1.4 Peptaibols活性分析方法  36
    2.1.5 哈茨木霉菌液体发酵培养  36-38
    2.1.6 XAD-2大孔吸附树脂分离  38-39
    2.1.7 葡聚糖凝胶LH-20分离  39-40
    2.1.8 高效薄层层析硅胶制备板分离  40
    2.1.9 HPLC制备分离  40-41
    2.1.10 Peptaibols的结构鉴定  41
  2.2 结果与分析  41-59
    2.2.1 哈茨木霉菌发酵液的生产  41-43
    2.2.2 XAD-2大孔树脂分离结果  43-45
    2.2.3 葡聚糖凝胶LH-20分离结果  45
    2.2.4 高效薄层层析硅胶板分离结果  45-47
    2.2.5 HPLC制备分离结果  47-48
    2.2.6 Peptaibols的结构鉴定结果  48-59
  2.3 本章小结  59-61
3 哈茨木霉菌发酵液中Peptaibols类抗菌肽活性研究  61-72
  3.1 材料与方法  61-64
    3.1.1 试验菌株  61
    3.1.2 仪器与试剂  61
    3.1.3 Peptaibols对植物病原真菌菌丝生长及菌丝形态影响  61-62
    3.1.4 Peptaibols对病原真菌孢子萌发影响  62
    3.1.5 Peptaibols对病原真菌菌核形成及萌发影响  62-63
    3.1.6 Peptaibols对病原真菌膜通透性影响  63-64
    3.1.8 Peptaibols与木霉素(Trichodermin)对病原真菌的联合作用  64
  3.2 结果与分析  64-71
    3.2.1 Peptaibols对病原真菌菌丝生长及菌丝形态影响  64-66
    3.2.2 Peptaibols对病原真菌孢子萌发影响  66
    3.2.3 Peptaibols对病原真菌菌核形成及萌发影响  66-67
    3.2.4 Peptaibols对病原真菌膜通透性影响  67
    3.2.5 Peptaibols对病原真菌细胞壁影响  67-68
    3.2.6 Peptaibols与木霉素(Trichodermin)对病原真菌的联合作用  68-71
  3.3 本章小结  71-72
4 总结与展望  72-74
  4.1 全文总结  72-73
  4.2 创新点  73
  4.3 展望  73-74
参考文献  74-79
作者简介  79

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 抗菌素制造
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