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水稻OsEXPB2基因的功能研究

作　者: 文文乙豪
导　师: 王贵学
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: OsEXPB2 功能研究 转录调控 蛋白互作
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


根是植物在演化过程中适应陆生环境的产物，它的出现是植物进化的一个标志。根系不仅是植物与外界环境进行物质交换的场所，还对地上部分起着固着和支撑作用。虽然根系的形态结构看起来很简单，但其发育的分子机制却十分复杂，受多种因素影响和调控。近年来，已发现多个与根系生长发育相关的基因，膨胀素就是最典型的一类。膨胀素是调控根系发育的一类重要的细胞壁松弛蛋白，在植物生长及一系列涉及细胞壁修饰的过程中发挥着重要作用。深入研究膨胀素基因的功能，将有利于我们更好地了解植物细胞壁松弛过程和根系的发生、发育及其调控机制，从而进一步认识植物的生长发育过程，为植物遗传改良提供依据。本研究对水稻β亚族的膨胀素基因OsEXPB2（登录号：AK061068）进行了生物信息学分析，并着重研究了其生物学功能，初步探明了与其互作的蛋白及其信号转导途径，主要研究结果如下：生物学特性分析结果表明，OsEXPB2基因全长1259bp，共编码261个氨基酸，主要由β-折叠和无规则卷曲构成，是一种稳定蛋白。亲疏水性及蛋白跨膜区域分析结果表明，OsEXPB2是一种亲水性蛋白，在第8～27位氨基酸之间有一个由内向外的跨膜螺旋。系统进化分析及氨基酸序列同源比对结果表明，OsEXPB2与OsEXPB3、TaEXPB23、TaEXPB11和ZmEXPB1等基因在同一个进化枝上。亚细胞定位及生理功能预测发现，OsEXPB2是一种分泌蛋白，定位在细胞外，主要参与蛋白质的转运及结合等过程。功能分析结果表明，OsEXPB2基因对水稻根系的形成及生长发育起着重要的调控作用。冷冻扫描电镜结果表明，干扰植株根表面极其光滑，没有根毛形成，说明OsEXPB2基因与根毛的形成紧密相关。组织切片结果进一步表明，干扰植株的表皮发育受阻，细胞形态发生显著变化，从而影响根毛的形成。此外，与野生型植株相比，内皮层细胞的形态大小及排列方式也存在较大差异。傅立叶变换远红外光谱实验结果表明，干扰植株细胞壁成分并无显著变化。转录调控分析结果表明，OsEXPB2基因的表达受众多因素影响和调控。启动子分析结果表明，该序列含有大多数高等植物启动子都具有的CAAT box和TATAbox等基本元件，以及大量的激素响应元件（如AuxRR，GARE和ABRE等）、组织特异性表达元件（如RHERPATEXPA7， ROOTMOTIFTAPOX1和OSE1ROOTNODULE等）和非生物胁迫响应元件（如DRE1，LTRE和MBS等）。RHE motif是这些根部特异性表达的膨胀素基因启动子的核心调控元件，对这些基因的特异性表达起着非常重要的调控作用。时空表达模式结果表明，在水稻不同生育期及不同组织中，OsEXPB2基因的表达存在显著差异性。OsEXPB2基因主要在水稻根部特异性表达，尤其在幼苗期的根里，而在水稻抽穗期叶片、花序，成熟期叶片、茎及小穗里都没有OsEXPB2基因表达。在缺磷及干旱条件下都能诱导OsEXPB2基因的表达，而脱落酸、赤霉素和吲哚乙酸处理后能抑制该基因的表达。互作蛋白研究结果表明，OsEXPB2能与OsGPB-LR蛋白互作。OsGPB-LR是一个鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β亚基的类似蛋白，主要由7组约40个氨基酸的Trp-Asp重复结构组成，与ABA信号途径蛋白的磷酸化及干旱胁迫紧密相关。综上所述，OsEXPB2是一个典型的细胞壁松弛蛋白，主要定位在细胞壁上，OsEXPB2基因的表达对水稻根毛的形成及发育具有重要的调控作用。本研究利用转基因技术将目的基因转入水稻来研究基因的功能及其调控机制。该研究在理论上对深入理解植物根系发育的分子机理有重要意义；在实践上可以应用于根系育种，补充和完善新时期的水稻育种理论。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
1 绪论  11-21
  1.1 前言  11-12
  1.2 膨胀素家族的研究进展  12-19
    1.2.1 膨胀素的发现及命名  12-13
    1.2.2 膨胀素的结构与功能  13-15
    1.2.3 膨胀素对根系生长发育的调控  15-19
  1.3 课题研究的目的、意义  19
  1.4 课题研究的内容及技术路线  19-20
    1.4.1 研究内容  19
    1.4.2 研究技术路线  19-20
  1.5 本研究的创新点  20-21
2 OsEXPB2 生物信息学分析  21-31
  2.1 实验方法  21
  2.2 结果分析  21-29
    2.2.1 初级结构分析  21
    2.2.2 二级结构分析  21-22
    2.2.3 疏水性分析  22-23
    2.2.4 跨膜区域分析  23
    2.2.5 信号肽分析  23-24
    2.2.6 亚细胞定位分析  24-25
    2.2.7 生理功能分析  25-26
    2.2.8 氨基酸序列同源性比对  26-28
    2.2.9 系统进化树分析  28-29
  2.3 讨论  29-31
3 OsEXPB2 亚细胞定位  31-37
  3.1 实验用品  31
    3.1.1 材料与试剂  31
    3.1.2 仪器  31
    3.1.3 培养基  31
  3.2 实验方法  31-32
    3.2.1 35S::OsEXPB2-GFP 载体的构建  31-32
    3.2.2 定位载体转化农杆菌  32
    3.2.3 定位载体转化洋葱表皮细胞  32
  3.3 结果分析  32-35
    3.3.1 亚细胞定位载体的克隆  32-33
    3.3.2 定位载体的 PCR 鉴定及酶切鉴定  33-34
    3.3.3 定位载体转化农杆菌的 PCR 鉴定  34
    3.3.4 亚细胞定位载体转化洋葱表皮细胞的检测  34-35
  3.4 讨论  35-37
4 OsEXPB2 互作蛋白研究  37-47
  4.1 实验用品  37-38
    4.1.1 材料与试剂  37
    4.1.2 仪器  37
    4.1.3 培养基  37-38
  4.2 实验方法  38-41
    4.2.1 酵母双杂交  38-39
    4.2.2 转化子鉴定  39
    4.2.3 共转化  39
    4.2.4 酵母载体的构建  39-40
    4.2.5 BiFC 载体的构建  40-41
    4.2.6 BiFC 共转化及荧光检测  41
  4.3 结果分析  41-46
    4.3.1 目的片段的克隆  41-42
    4.3.2 酵母载体转 DH5α的 PCR 鉴定  42
    4.3.3 转化子鉴定及共转化结果  42-43
    4.3.4 BiFC 目的片段的克隆  43-44
    4.3.5 BiFC 目的片段的酶切鉴定  44-45
    4.3.6 BiFC 载体的 PCR 鉴定  45
    4.3.7 BiFC 载体转农杆菌的 PCR 鉴定  45-46
    4.3.8 BiFC 验证蛋白互作  46
  4.4 讨论  46-47
5 OsEXPB2 干扰载体的构建及转基因水稻的功能鉴定  47-69
  5.1 实验用品  47-49
    5.1.1 材料与试剂  47
    5.1.2 仪器  47-48
    5.1.3 培养基  48-49
  5.2 实验方法  49-57
    5.2.1 干扰载体（RNAi-OsEXPB2）的构建  49-50
    5.2.2 OsEXPB2 片段的回收  50
    5.2.3 OsEXPB2 与 pENTR-TOPO 载体的连接  50
    5.2.4 OsEXPB2 与 pENTR-TOPO 载体的转化  50-51
    5.2.5 质粒的提取  51
    5.2.6 阳性克隆的鉴定及测序  51
    5.2.7 载体重组  51-52
    5.2.8 干扰载体转化农杆菌  52
    5.2.9 农杆菌介导的水稻转化方法  52-53
    5.2.10 干扰植株的 qPCR 检测  53-55
    5.2.11 相关生理生化指标的检测  55-57
  5.3 结果分析  57-68
    5.3.1 干扰载体的构建  57-58
    5.3.2 干扰载体转化农杆菌的 PCR 鉴定  58-59
    5.3.3 转基因水稻 RNAi 阳性植株的鉴定  59
    5.3.4 实时荧光定量检测  59-61
    5.3.5 形态学分析  61-64
    5.3.6 组织解剖学分析  64-67
    5.3.7 冷冻扫描电镜观察  67
    5.3.8 傅立叶红外光谱分析细胞壁成分  67-68
  5.4 讨论  68-69
6 转录调控分析  69-87
  6.1 实验用品  69
    6.1.1 材料与试剂  69
    6.1.2 仪器  69
  6.2 实验方法  69-71
    6.2.1 启动子生物信息学分析  69
    6.2.2 水稻 OsEXPB2 基因启动子的克隆  69-70
    6.2.3 水稻 POsEXPB2::GUS 载体的构建  70-71
    6.2.4 POsEXPB2::GUS 与 pMD-19T 载体的连接  71
    6.2.5 CaCl_2法大肠杆菌感受态的制备与转化  71
  6.3 实验结果  71-84
    6.3.1 启动子生物信息学分析  71-77
    6.3.2 时空表达模式分析  77-80
    6.3.3 非生物胁迫分析  80-81
    6.3.4 启动子的克隆  81-83
    6.3.5 启动子 GUS 活性检测  83-84
  6.4 讨论  84-87
7 主要结论、后续工作和展望  87-89
  7.1 主要结论  87-88
  7.2 后续工作和展望  88-89
致谢  89-91
参考文献  91-97
附录  97-107

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生物化学
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