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乙脑E基因和猪白细胞介素6基因重组腺病毒的构建与初步免疫研究

作　者: 刘凯
导　师: 文心田
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 重组腺病毒 乙脑 白细胞介素6 免疫原性 小鼠模型
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis virus, JEV),又称日本乙型脑炎,简称乙脑,是由日本乙型脑炎病毒引起一种人畜共患的虫媒病毒性疾病,给人类及养殖业带来极大的危害。E蛋白是乙脑主要的抗原蛋白,猪的白细胞介素6基因能够起到免疫增强的作用,本研究构建了腺病毒重组乙脑E基因和猪白细胞介素6基因,包装了携带两个基因的重组腺病毒,并以小鼠为模型进行了前期初步免疫评价。1.携带E基因和IL6基因的穿梭质粒的构建设计引物,采用RT-PCR方法从乙脑标准株(SA14-14-2)中扩增E基因(1500bp),以真核表达质粒pIRES为模板,扩增出核糖体进入位点IRES基因,以实验室保存的T-IL6质粒为模板,扩增出IL6基因。将IRES和IL6基因采用重叠PCR方法顺次串联在一起,依次将E基因和IRES和IL6串联基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV多克隆位点上。经PCR和双酶切鉴定,成功构建了穿梭质粒pAdTrack-CMV-E-IL6-IRES.2.重组腺病毒质粒的构建及重组腺病毒的包装首先将带有腺病毒骨架载体Ad-easy1的BJ5183菌做成电转感受态,然后将线性化好的穿梭质粒电转进入含骨架载体的感受态中。经鉴定成功重组出携带目的基因重组腺病毒质粒Ad-easy-E-IRES-IL6.将重组腺病毒质粒线性化后转染293细胞,经过RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光鉴定,成功包装出含目的基因的重组腺病毒,并且目的基因在病毒中能够表达出具有活性的蛋白。3.腺病毒介导的乙脑E基因和猪白细胞介素6基因疫苗的初步免疫评价将重组腺病毒纯化后分别采用口服、滴鼻和注射三种方式免疫小鼠。同时设乙脑弱毒疫苗注射组和PBS注射组作为对照组。所有组别都每隔2周免疫一次一共免疫三次,分别在免疫后第2w、4w、6w、8w以间接ELISA检测血清IgG和IgA抗体,以试剂盒检测血清γ-干扰素和IL-6水平。结果表明：在首免后第2w,可以检测到血清IgG抗体和黏膜IgA抗体,但重组腺病毒抗体水平要低于弱毒疫苗组,其中滴鼻组明显低于疫苗组(P<0.01)。加强免疫后第4w重组腺病毒口服组和疫苗组基本达到抗体最高峰,并且腺病毒口服组抗体水平显著高于疫苗组(P<0.05),第6-8w两种抗体水平均维持在一个较高的水平。间接ELISA检测小鼠血清中的IFN-γ和IL-6含量,结果显示：首免后第2w起,各组的IFN-γ和IL-6含量明显升高,而PBS对照组的含量始终维持在一个较低水平。免疫后4周,细胞因子IFN-γ和IL-6含量基本达到最高水平,其中重组腺病毒口服组明显高于其他组别(P<0.05)。重组腺病毒三种免疫方式都能使小鼠血清中两种细胞因子水平都有不同程度的上升,反应出重组腺病毒能够激发小鼠产生Th1/Th2混合型细胞免疫。结果表明重组腺病毒免疫小鼠具有良好的免疫原性,可诱导免疫小鼠产生特异性的血清IgG以及IgA抗体,同时能诱发明显的细胞免疫应答。其中三种免疫方式中口服免疫达到的抗体水平最高,基本和弱毒疫苗抗体水平相当,甚至有时间段还高于弱毒疫苗抗体水平。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章 文献综述  13-24
  1. 乙型脑炎病毒研究进展  13-20
    1.1 流行病学  13-14
    1.2 分类及分型  14-15
    1.3 分子生物学  15-19
      1.3.1 JEV病毒粒子结构  15-16
      1.3.2 JEV病毒基因组的结构特征  16
      1.3.3 乙脑蛋白的结构和功能  16-19
    1.4 发展中的乙脑基因工程疫苗的现状  19-20
  2. 腺病毒载体研究进展  20-23
    2.1 腺病毒的生物学特点  20-21
    2.2 腺病毒载体的类型  21-23
    2.3 腺病毒载体的优点  23
  3. 研究目的和意义  23-24
第二章 研究部分  24-68
  1 材料  24-26
    1.1 生物材料  24
    1.2 试剂  24-25
    1.3 试剂配制  25-26
    1.4 主要仪器设备  26
  2. 方法  26-45
    2.1 乙脑E基因的克隆及ires基因与il6基因的扩增和串联  26-33
      2.1.1 引物设计及合成  26-27
      2.1.2 乙脑E基因的克隆  27-28
      2.1.3 E基因T-A克隆载体的构建与鉴定  28-30
      2.1.4 E基因克隆质粒的鉴定  30-31
      2.1.5 IRES基因与IL6基因的扩增和串联  31-33
    2.2 重组腺病毒穿梭质粒的构建  33-37
      2.2.1 技术路线图  33-34
      2.2.2 pAdTrack-CMV-E质粒的构建  34-35
      2.2.3 pAdTrack-CMV-E-IRES-IL6质粒的构建  35-37
    2.3 重组腺病毒质粒的构建  37-38
      2.3.1 线性化穿梭质粒pAdTrack-CMV-E-IRES-IL6  37
      2.3.2 含复制缺陷型腺病毒载体的Bj5183感受态的制备  37-38
      2.3.3 穿梭质粒与腺病毒载体的重组  38
      2.3.4 筛选阳性克隆  38
    2.4 重组腺病毒的包装  38-40
      2.4.1 线性化阳性质粒  38-39
      2.4.2 重组腺病毒转染293细胞  39
      2.4.3 病毒的收获,传代  39-40
    2.5 重组腺病毒的鉴定  40-42
      2.5.1 RT-PCR检测  40
      2.5.2 免疫荧光检测  40-41
      2.5.3 电镜检测  41
      2.5.4 蛋白印迹检测  41-42
    2.6 重组腺病毒的增殖和纯化  42
    2.7 重组腺病毒滴度的测定  42
    2.8 动物免疫试验  42-45
      2.8.1 动物免疫方式及处理  42-43
      2.8.2 特异性乙脑血清IgG和粘膜IgA抗体测定  43-44
      2.8.3 免疫小鼠白细胞介素6(IL-6)和干扰素γ(IFN-γ)的测定  44-45
  3. 结果与分析  45-63
    3.1 重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E-IRES-IL6质粒的构建及鉴定  45-48
      3.1.1 E基因、IRES基因和IL6基因的扩增结果  45
      3.1.2 M基因重组质粒pMD19T-E的鉴定  45-46
      3.1.3 IRES基因和IL6基因的串联  46-47
      3.1.4 E基因和穿梭载体连接结果及IRES基因和IL6基因的串联基因与穿梭载体连接的结果  47-48
    3.2 重组腺病毒载体的构建及鉴定  48-49
    3.3 重组腺病毒包装结果  49-51
    3.4 重组腺病毒鉴定结果  51-55
      3.4.1 重组腺病毒RT-PCR鉴定结果  51
      3.4.2 电镜检测结果  51-52
      3.4.3 免疫荧光检测结果  52-53
      3.4.4 免疫印迹检测结果  53-54
      3.4.5 重组腺病毒滴度的测定结果  54-55
    3.5 乙脑重组腺病毒初步免疫结果  55-63
      3.5.1 抗乙脑特异性血清IgG的检测  55-56
      3.5.2 抗JEV特异性血清IgA检测  56-58
      3.5.3 免疫小鼠细胞因子的定量检测  58-63
  4. 讨论  63-67
    4.1 表达系统的选择  63
    4.2 目的基因的选择  63-64
    4.3 引入IRES序列  64
    4.4 重组腺病毒的包装及纯化  64-65
    4.5 外源基因的转录和表达  65
    4.6 动物免疫实验  65-67
  5. 结论  67-68
参考文献  68-73
致谢  73

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜免疫学
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