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类猪圆环病毒2型因子P1感染Balb/c小鼠模型的建立

作　者: 高晓静
导　师: 何孔旺
学　校: 南京农业大学
专　业: 兽医
关键词: 类猪圆环病毒2型因子P1 Balb/c小鼠 感染模型 实时荧光定量PCR 免疫组化 血常规
分类号: S852.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


猪圆环病毒(PCV)是一种无囊膜、共价闭合、单股环状DNA病毒,属于圆环病毒科,圆环病毒属。PCV包括PCV-1和PCV-2两个型,PCV-1对猪为非致病性的,PCV-2与猪的多种疾病综合征有关。PCV-2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,但仅有PCV-2并不足以引发典型症状。本实验室在诊断PMWS的过程中,检测到一种新的病毒因子P1。P1是环状DNA,有648个核苷酸,部分与PCV-2ORF2高度同源。虽然现在对P1因子的生物学特性以及其与PCV-2的鉴别诊断上有了初步研究,但是有关其在动物体内的增殖规律、致病机理尚不清楚,需要建立P1感染模型来进一步研究。首先,建立了实时荧光定量PCR检测方法。根据P1因子的基因序列设计合成了一对引物和探针,通过对反应条件和反应体系的优化,成功建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。该方法具有特异、灵敏、快速等优点,在101-108拷贝/μL之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90%-105%之间。其次,对P1感染Balb/c小鼠的模型进行了研究。健康的Balb/c小鼠经腹腔注射P1细胞毒,通过比较体重增长率,检测P1对小鼠的直接影响；利用建立的实时荧光定量PCR结合ELISA方法、免疫组化技术,研究P1因子感染后Balb/c小鼠组织中病毒核酸含量的动态变化、P1因子抗体水平变化以及抗原在组织中的定位。体重增长率的结果表明,攻毒后第14d、21d,3次攻毒组的小鼠体重增长率明显小于空白对照组：ELISA方法在整个攻毒周期均检测到P1抗体；荧光定量PCR在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、膀胱、睾丸、脑、胸腺和胰腺中检测到病毒核酸；免疫组化技术在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、睾丸和胸腺中检测到阳性细胞。这些结果都表明P1感染动物模型构建成功。该动物模型的建立为进一步研究P1的致病性和致病机理奠定了基础。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
第一部分 文献综述  10-32
  第一章 猪圆环病毒及类猪圆环病毒的研究进展  10-22
    1 引言  10-11
    2 病原学  11-12
    3 流行病学  12-13
    4 临床症状与病理变化  13
    5 致病机理  13-16
    6 实验室诊断方法  16-22
      6.1 电镜法  16
      6.2 免疫组织化学方法(IHC)  16-17
      6.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)  17-18
      6.4 免疫胶体金技术  18
      6.5 间接免疫荧光试验(IFA)  18-19
      6.6 聚合酶链式反应(PCR)  19-21
      6.7 原位杂交技术(ISH)  21
      6.8 基因芯片检测技术  21-22
  第二章 实验动物模型的相关研究  22-25
    1 猪感染模型  22-23
    2 小鼠感染模型  23-25
  参考文献  25-32
第二部分 试验研究  32-68
  第一章 类猪圆环病毒2型因子P1 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立  32-46
    摘要  32
    1 材料和方法  32-35
      1.1 病毒  32
      1.2 TaqMan探针与引物  32-33
      1.3 主要试剂  33
      1.4 主要仪器  33
      1.5 类猪圆环病毒2型因子P1 DNA模板的制备  33
      1.6 实时荧光定量PCR条件的优化  33-34
      1.7 实时荧光定量标准曲线的制定  34-35
      1.8 荧光定量特异性、敏感性及重复性检测  35
      1.9 实时荧光定量PCR检测临床样品  35
    2 结果与分析  35-41
      2.1 P1目的基因片段的扩增与重组质粒的构建  35
      2.2 实时荧光定量PCR条件的优化  35-38
      2.3 特异性分析  38
      2.4 敏感性分析  38-39
      2.5 重复性检测  39-40
      2.6 P1阳性样品的检测  40-41
    3 讨论  41-43
    参考文献  43-44
    ABSTRACT  44-46
  第二章 类猪圆环病毒2型因子P1感染Balb/c小鼠模型的研究  46-68
    摘要  46
    1 材料和方法  46-51
      1.1 病毒  46
      1.2 实验动物  46-47
      1.3 主要的试剂  47
      1.4 主要仪器  47
      1.5 分组与攻毒  47
      1.6 临床症状观察  47-48
      1.7 血常规检测  48
      1.8 ELISA  48
      1.9 动物组织中P1 DNA的提取  48
      1.10 实时荧光定量PCR  48-49
      1.11 免疫组化  49-51
    2 结果与分析  51-62
      2.1 临床症状观察  51-54
      2.2 小鼠血常规检测结果  54-56
      2.3 血清学检测结果  56-57
      2.4 实时荧光定量PCR  57-60
      2.5 免疫组化法检测P1在小鼠体内的分布  60-62
    3 讨论  62-66
    参考文献  66-67
    ABSTRACT  67-68
全文总结  68-70
附录 常用试剂配制  70-73
致谢  73

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学 > 猪瘟病毒
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