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合作猪肾成纤维细胞系的构建及生物学鉴定

作　者: 阮小华
导　师: 冯玉萍
学　校: 西北民族大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 合作猪成纤维细胞免疫组化核型分析同工酶分析转染
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

西北民族大学硕士学位论文本文选取国家级禽畜遗传保护品种——合作猪,利用动物细胞培养技术,通过差速贴壁和差速消化法,构建了15个合作猪肾原代成纤维细胞系,并冻存细胞200余支。根据ATCC细胞建系要求,对其培养条件和生物学特性进行了分析。结果：倒置相差显微镜下细胞呈梭形或柳树叶形,生长旺盛,经48～72h培养,细胞长满单层,生长走势呈放射状或旋涡状。透射电镜显示胞浆内有纤维状结构存在。免疫组化显示波形蛋白阳性,角蛋白阴性。经DMEM(H)、MEM、RPMI1640和HamF12四种培养基各加10%FBS选择培养的结果表明,DMEM(H)培养基加10%FBS最适合对该细胞的培养。间歇降温冻存法冻存的细胞,复苏后细胞生长状态良好,生长曲线呈“S”型,细胞经历了潜伏期、对数期与停滞期,符合细胞体外生长规律。冻存前细胞平均成活率97%,复苏后为95%,说明该法冻存细胞效果良好。细胞核型分析显示：合作猪肾成纤维细胞染色体数目为2n=38,其中18对常染色体,1对性染色体,y染色体为最小的中着丝粒染色体。分别统计雌雄个体来源细胞的100个细胞中期分裂相,结果为雌性2n=38占88%,雄性90%,表明所建细胞系为二倍体细胞占主体,遗传性能稳定。SDS凝胶电泳显示细胞的乳酸脱氢酶酶谱为五条区带,不同个体来源细胞经多次重复结果相同,表明所建细胞系没有发生交叉污染。脂质体介导绿色、红色荧光蛋白报告质粒转染,分别获得45%、35%的细胞转染率,表明合作猪肾成纤维细胞能有效地转染表达外源基因。细菌、真菌、支原体和病毒外源因子感染的检测结果均为阴性。结论：所构建并冻存的合作猪肾成纤维细胞系符合ATCC建系要求,为合作猪的基因组文库构建、体细胞克隆及基因遗传多样性研究等储备了理想的生物学材料,为基因工程疫苗的构建储备了细胞载体,同时也可为组织工程肾提供种子细胞。

全文目录

中文摘要  3-4
Abstract  4-5
缩略词表  5-9
第一部分文献综述  9-15
  1.1. 动物细胞培养技术及其应用  9-10
    1.1.1 动物细胞培养的发展历史  9-10
    1.1.2 动物细胞培养的应用  10
  1.2. 细胞生物学特性研究  10-14
    1.2.1 细胞形态学鉴定  10-11
    1.2.2 细胞复苏活力检测  11
    1.2.4 生长曲线的绘制  11
    1.2.5 细胞系的微生物污染检测  11-12
    1.2.6 细胞染色体核型分析  12-13
    1.2.7 细胞同工酶酶谱分析  13
    1.2.8 荧光蛋白报告质粒在成纤维细胞中的表达  13-14
  1.3 建立合作猪肾成纤维细胞系的意义  14-15
第二部分实验材料  15-20
  2.1 主要仪器  15
  2.2 主要菌株  15
  2.3 主要试剂  15-16
  2.4 主要试剂的配置  16-19
    2.4.1 MEM培养液的配置  16
    2.4.2 DMEM培养液的配置  16
    2.4.3 RPMI1640培养液的配置  16
    2.4.4 HamF12培养液的配置  16
    2.4.5 0.25%胰蛋白酶溶液的配置  16
    2.4.6 PBS溶液的配置  16-17
    2.4.7 秋水仙素溶液的配置  17
    2.4.8 Giemsa染料的配置  17
    2.4.9 细胞冻存保护液的配置  17
    2.4.10 THIO的配置  17
    2.4.11 TSB的配置  17
    2.4.12 Hoechst 33258的配制  17
    2.4.13 4%多聚甲醛的配制  17-18
    2.4.14 增补剂与抑菌剂  18
    2.4.15 支原体液体培养基的制备  18
    2.4.16 同工酶分析所用试剂的配置  18-19
      2.4.16.1 A液的配置  18
      2.4.16.2 B液的配置  18
      2.4.16.3 C液的配置  18
      2.4.16.4 D液的配置  18-19
      2.4.16.5 E液的配置  19
      2.4.16.6 乳酸脱氢酶染色液配制  19
  2.5 实验动物  19-20
第三部分合作猪肾成纤维细胞系的构建  20-32
  3.1 细胞培养操作  20-21
    3.1.1 原代培养  20
    3.1.2 细胞传代  20-21
  3.2 成纤维细胞的纯化与鉴定  21-22
    3.2.1 成纤维细胞的纯化  21
    3.2.2 成纤维细胞的鉴定  21-22
      3.2.2.1 成纤维细胞形态和结构鉴定  21-22
      3.2.2.2 成纤维细胞免疫组化鉴定  22
  3.3 细胞冻存  22
  3.4 细胞复苏  22-23
  3.5 细胞复苏活力检测  23
  3.6 生长曲线的绘制  23
  3.7 细胞对培养液的选择  23-24
  3.8 结果  24-29
    3.8.1 成纤维细胞形态学观察  24-26
      3.8.1.1 原代细胞形态  24
      3.8.1.2 传代细胞形态  24
      3.8.1.3 纯化后的细胞形态  24
      3.8.1.4 复苏后的细胞形态  24-26
    3.8.2 成纤维细胞鉴定结果  26-28
      3.8.2.1. 成纤维细胞形态和亚显微结构  26-27
      3.8.2.2 成纤维细胞免疫组化染色结果  27-28
    3.8.3 成纤维细胞复苏活力检测结果  28
    3.8.4 成纤维细胞生长曲线和培养液选择结果  28-29
  3.9. 讨论  29-32
    3.9.1 影响细胞培养的因素  29-30
    3.9.2 成纤维细胞的纯化  30
    3.9.3 成纤维细胞对培养液的选择  30-31
    3.9.4 成纤维细胞的免疫组化鉴定  31-32
第四部分合作猪肾成纤维细胞系的鉴定  32-47
  4.1 染色体核型分析  32-33
    4.1.1 染色体制备  32
    4.1.2 核型分析  32-33
  4.2 乳酸脱氢酶同工酶酶谱分析  33-34
    4.2.1 样品的制备  33-34
    4.2.2 电泳  34
  4.3 荧光蛋白报告质粒在合作猪肾成纤维细胞中的转染表达  34-35
  4.4 微生物污染检测  35-37
    4.4.1 细菌检测  35
    4.4.2 真菌检测  35-36
    4.4.3 支原体检测  36
    4.4.4 病毒检测  36-37
  4.5 结果  37-44
    4.5.1 染色体分析结果  37-40
    4.5.2 乳酸脱氢酶同工酶酶谱分析结果  40
    4.5.3 荧光蛋白报告质粒转染结果  40-42
    4.5.4 微生物污染检测结果  42-44
      4.5.4.1 细菌污染检测结果  42
      4.5.4.2 真菌污染检测结果  42
      4.5.4.3 支原体污染检测结果  42-43
      4.5.4.4 病毒检测结果  43-44
  4.6 分析  44-47
    4.6.1 细胞遗传学性状检测  44-45
    4.6.2 乳酸脱氢酶同工酶酶谱分析  45
    4.6.3 荧光蛋白报告质粒在成纤维细胞中的表达  45-46
    4.6.4 微生物污染对细胞培养的影响及污染检测  46-47
第五部分结论  47-48
参考文献  48-52
附录  52-55
致谢  55

合作猪肾成纤维细胞系的构建及生物学鉴定

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