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多型FMDV的VP1表位基因在S-层蛋白嵌入型亚单位疫苗载体的构建及其初步鉴定

作　者: 王敏
导　师: 格日勒图
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒 VPI基因 S-层蛋白原核表达亚单位疫苗
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth virus disease, FMDV)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病,主要感染牛、猪和羊等多种家畜和野生哺乳动物,对畜牧产业和国民经济造成严重的损失。FMD已经成世界性分布。虽然化学方法灭活的全病毒疫苗在FMD的预防和控制过程中发挥着重要的作用,但是,在疫苗应用实践中凸显出很多不足。如纯化病毒颗粒难度大,病毒株储存条件苛刻,疫苗接种免疫效果不稳定等。更为重要的潜在危险还有在疫苗大规模生产过程中,FMDV的未完全灭活和来自疫苗生产期间从生物安全设施中逃脱的活病毒等。此外,多年以来我国的FMD疫情表现了0、A、Asia I多个血清型交替流行,单一种类型疫苗难以成效,导致疫苗免疫效果不尽人意。本研究应用PCR方法从嗜酸性乳杆菌基因组DNA中成功扩增出约1200bp的S-层蛋白全基因。应用CPH models-3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels)、 Swiss-Model和Swiss-PdbViewer等3种在线软件成功预测了乳杆菌SLP的高级结构。将s1p基因克隆到原核表达载体pGEX4t-3中,成功构建了原核表达载体pGEX-slp。经IPTG诱导表达而获得的GST-SLP融合蛋白大小为70kDa。相继研究中将0、A、Asia I等3型FMDV的VPl特定表位基因嵌入到乳杆菌S-层蛋白原核表达载体pGEX-slp中,并转化到大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting鉴定,结果表明VP1融合蛋白在大肠杆菌中表达量是有限的,融合蛋白大小约为80kDa。本研究为进一步研究多型FMDV VP1表位基因嵌入型亚单位基因工程疫苗奠定基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
1 引言  7-17
  1.1 S-层蛋白概述  7-12
    1.1.1 乳酸杆菌S-层蛋白  7-9
    1.1.2 关于S-层蛋白的应用  9-12
  1.2 关于口蹄疫的概述  12-16
    1.2.1 口蹄疫病毒及其结构蛋白  12-13
    1.2.2 VP1蛋白质的特征  13
    1.2.3 VP1蛋白的抗原性  13-16
  1.3 本研究的目的和意义  16-17
2 嗜酸乳杆菌MG株S-层蛋白的高级结构预测分析及原核表达  17-29
  2.1 材料  17-18
    2.1.1 质粒与菌种  17
    2.1.2 工具酶及试剂  17
    2.1.3 仪器与设备  17-18
    2.1.4 引物设计  18
  2.2 方法  18-21
    2.2.1 嗜酸乳杆菌的s1p基因PCR扩增  18
    2.2.2 嗜酸乳杆菌的s1p基因PCR扩增产物的纯化  18-19
    2.2.3 嗜酸乳杆菌的s1p基因的连接与转化  19-20
    2.2.4 SLP蛋白质的三级结构预测  20
    2.2.5 原核表达载体pGEX-slp的构建  20
    2.2.6 重组质粒表达条件的优化  20
    2.2.7 SDS-PAGE电泳  20-21
    2.2.8 Western blotting检测  21
  2.3 结果  21-27
    2.3.1 s助基因的PCR扩增产物  21-22
    2.3.2 pMD-s1p双酶切鉴定  22
    2.3.3 嗜酸乳杆菌SLP蛋白质的氨基酸序列的预测  22-23
    2.3.4 SLP蛋白质的高级结构预测  23-24
    2.3.5 重组载体pGEX-slp的酶切鉴定和PCR鉴定  24-25
    2.3.6 s助基因原核表达条件的优化  25-26
    2.3.7 SDS-PAGE与Western blotting分析结果  26-27
  2.4 讨论  27-29
3 多型口蹄疫病毒VP1基因表位嵌入型S-层蛋白原核表达载体的构建  29-37
  3.1 材料  29-30
    3.1.1 重组质粒与VP1基因来源  29
    3.1.2 工具酶和试剂  29
    3.1.3 仪器与设备  29-30
  3.2 方法  30-31
    3.2.1 3型口蹄疫病毒的VP1的核苷酸序列分析  30
    3.2.2 3型口蹄疫病毒的VP1的氨基酸序列分析  30
    3.2.3 3型口蹄疫病毒的VP1的表面特性分析  30
    3.2.4 重组表达载体的构建  30
    3.2.5 重组表达质粒的诱导表达  30
    3.2.6 表达产物的鉴定  30-31
  3.3 结果  31-35
    3.3.1 3型口蹄疫病毒的VP1的核酸分析  31
    3.3.2 3型口蹄疫病毒的VP1的氨基酸分析  31-32
    3.3.3 3型口蹄疫病毒的VP1的表面特性分析  32-33
    3.3.4 重组质粒pGEX-s1p-MultiVP1的双酶切鉴定  33-34
    3.3.5 SDS-PAGE电泳  34
    3.3.6 Western blotting检测  34-35
  3.4 讨论  35-37
4 结论  37-38
致谢  38-39
参考文献  39-47
作者简介  47

多型FMDV的VP1表位基因在S-层蛋白嵌入型亚单位疫苗载体的构建及其初步鉴定

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