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新型鸭呼肠孤病毒的鉴定及其全基因组序列解析

作　者: 朱英奇
导　师: 刘光清
学　校: 安徽农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新型鸭源呼肠孤病毒太湖2011（DRVTH11）株 分离 鉴定 生物学特性 基因组序列 分子进化
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


2011年上半年，中国太湖流域的许多养鸭场陆续发生一种新的鸭病毒性传染病，临床主要表现为发病雏鸭精神萎靡，软脚，排白色稀粪，发病率约40%，病率在35%-40%以上，给养鸭业造成了较为严重的经济损失。为了分离该病的病原，我们从太湖发病鸭场采集发病鸭实质脏器，通过接种SPF鸡胚进行病毒分离。结果从鸡胚尿囊液中分离到一株病毒，经测定该病毒尿囊液的ELD50为105.5/0.2mL。将该病毒尿囊液感染1日龄樱桃谷肉鸭可复制出与临床相同的症状，且可从发病鸭的脾脏和肝脏中分离到病毒，该结果表明我们分离到的病毒为造成这次疾病发生的病原。通过PCR、RT-PCR检测方法对该病毒进行检测，结果排除了所有常见的或者是具有地方流行特点的鸭病毒性传染病，包括鸭病毒性肠炎病毒、鸭肝炎病毒、禽流感病毒、鸭黄病毒、鸭细小病毒和番鸭呼肠孤病毒。为了确定该病毒的分类学地位，首先，我们通过病毒核酸类型的鉴定、有机溶剂敏感性试验和血凝性试验证明该病毒为RNA病毒、无囊膜、不具有鸡血红细胞凝集活性。然后，将病毒尿囊液经蔗糖密度梯度离心纯化进行电镜观察，发现该病毒粒子直径约70nm、呈球形、正二十面体对称和双层衣壳结构，病毒具有典型的正呼肠孤病毒科成员的特性。最后，我们参考番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）89026株S2基因的部分序列设计合成了一对引物，对该病毒的核酸序列进行了测定，同时对该序列进行遗传进化分析，结果表明该病毒与2009年从福建分离到的新型鸭呼肠孤病毒（Duck reovirus，DRV）NP03株亲缘关系很近处在同一进化分支，而与番鸭呼肠孤病毒亲缘关系较远。至此，我们分离并鉴定出造成鸭群中这次疫病流行的病原为新型鸭源呼肠孤病毒。根据国际命名规则，将该病毒命名为新型鸭呼肠孤病毒太湖2011株（DRVTH11）。为了了解该病毒的增殖特性，我们将病毒感染BHK-21细胞系，对其一步生长曲线进行了测定。研究表明DRV TH11株病毒可在BHK-21细胞系上增殖,出现细胞巨融合病变，通过WB、IFA方法均能在细胞内检测到该病毒的存在。一步生长曲线显示，该毒株感染BHK-21细胞后0-12h为潜伏期，12h后开始增殖，12-36h进入快速增殖期，48h病毒滴度即达到最高，TCID50为106.57/0.1mL，随后病毒的增殖随细胞的崩解而降低。为了了解该病毒分子遗传信息，我们通过RT-PCR方法对病毒基因组进行扩增，成功获得覆盖DRV TH11株病毒全基因组的若干目的片段克隆。序列拼接后显示病毒基因组全长为23,418bp，病毒基因组有十个基因片段组成，大小如下：L1,3958bp；L2,3829bp；L3,3907bp；M1,2283bp；M2,2158bp；M3,1996bp；S1,1568bp；S2,1326bp；S3,1202bp；S4,1191bp。与呼肠孤病毒科其他成员一样，该病毒每个基因片段在5’末端和3’末端均存在保守序列，为5’-GCUUUUU和3’-UCAUC。其中除了S1节段含有三个ORF以外，每个节段只含有一个完整的ORF,所以推测病毒基因组至少编码12个蛋白。为了明确DRVTH11株病毒与其他禽源呼肠孤病毒之间的同源性关系，我们分别挑选了MDRV代表株89026株和鸡源呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus, ARV）代表株S1133株进行基因组同源性分析。结果显示，DRVTH11株病毒M1、M3、S2、S4基因片段与MDRV的核苷酸同源性较高为81.8%-87.8%，M2、S3基因片段同源性较低为68.5%和69.8%，S1基因片段同源性最低仅为34.4%；该病毒基因组与ARV的核苷酸同源性均较低为69.0%-79.2%，其中S1片段与ARV核苷酸同源性仅为46.3%。进一步分析发现，整个基因组中S1片段变异最显著：DRV TH11株病毒S1片段长为1568bp，MDRV为1124bp，ARV为1643bp；其中MDRV仅编码两个蛋白（p10、σC），而ARV与DRV TH11均编码三个蛋白（p10、p17、σC），DRV TH11株编码的这三个蛋白与ARV、MDRV对应氨基酸同源性均很低，分别为12.5%和28.6%、26.5%、25.2%和40.0%。这一结果表明，DRVTH11株病毒为区别于ARV和MDRV的新型鸭呼肠孤病毒。为了进一步了解该病毒与MDRV和ARV之间的进化关系，我们分别挑选了σC基因序列和μB基因序列进行分子进化分析。首先，通过对σC基因和μB基因绘制进化树，我们发现：可将禽源呼肠孤病毒划分为3个不同的进化群，ARV、MDRV和DRV分别处在不同的分支，应为三种不同的病毒。其次，通过σC基因绘制的进化树发现：DRVTH11株与MDRV亲缘关系更近，共同构成一个主干支，ARV单独处在另一个主干支；同时，通过对μB基因绘制进化树我们发现：DRV TH11株病毒却与ARV亲缘关系较近，共同构成一个主干枝，而MDRV则处在另一个主干枝。这一结果提示我们，该病毒的不同基因片段的进化来源不同，并非单纯的由ARV或是MDRV进化而来，可能是由MDRV和ARV病毒在同一宿主中发生了基因重排而进化产生，这一推理仍需进一步验证。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-12
附表和插图清单  12-13
英文缩略表  13-14
文献综述  14-21
1 引言  21-22
2 材料与方法  22-34
  2.1 材料  22-23
    2.1.1 样品采集  22
    2.1.2 SPF 鸡胚与实验动物  22
    2.1.3 细胞系  22
    2.1.4 主要试剂及试剂盒  22
    2.1.5 主要溶液及培养基的配制  22-23
    2.1.6 主要仪器  23
  2.2 方法  23-34
    2.2.1 鸭源呼肠孤病毒的分离与生物学鉴定  23-29
      2.2.1.1 病料的采集及处理  24
      2.2.1.2 病毒的 SPF 鸡胚分离  24
      2.2.1.3 病毒鸡胚半数致死量（ELD50）的测定  24
      2.2.1.4 动物回归试验  24
      2.2.1.5 常见鸭病毒病的检测  24
      2.2.1.6 血凝试验  24
      2.2.1.7 有机溶剂敏感性试验  24
      2.2.1.8 病毒的核酸类型鉴定  24-25
      2.2.1.9 病毒的纯化  25-26
      2.2.1.10 电镜负染色观察  26
      2.2.1.11 RT-PCR 检测及序列进化分析  26-29
    2.2.2 病毒在 BHK-21 细胞系上的增殖特性研究  29-30
      2.2.2.1 病毒在 BHK-21 细胞系上的适应性试验  29
      2.2.2.2 病毒细胞半数致死量（TCID50）测定  29
      2.2.2.3 RT-PCR 检测  29
      2.2.2.4 Western blot 检测  29-30
      2.2.2.5 IFA 检测  30
      2.2.2.6 一步生长曲线绘制  30
    2.2.3 动物致病性试验  30-32
      2.2.3.1 麻鸭致病性试验  30
      2.2.3.2 病理组织切片观察  30-31
      2.2.3.3 免疫组织化学检测  31
      2.2.3.4 SPF 鸡致病性试验  31-32
    2.2.4 鸭源呼肠孤病毒全基因组序列测定及分析  32-34
      2.2.4.1 引物的设计与合成  32-33
      2.2.4.2 病毒 RNA 的提取  33
      2.2.4.3 cDNA 的合成  33
      2.2.4.4 PCR 扩增  33-34
      2.2.4.5 RT-PCR 产物的纯化  34
      2.2.4.6 纯化产物与 PMD-19T 载体的连接与转化  34
      2.2.4.7 阳性克隆的挑选与鉴定  34
      2.2.4.8 阳性质粒的提取  34
      2.2.4.9 基因序列测定  34
      2.2.4.10 病毒基因组结构的分析、基因组序列相似性分析及系统进化分析  34
3 结果与分析  34-50
  3.1 鸭源呼肠孤病毒的分离与生物学鉴定  34-37
    3.1.1 病毒的 SPF 鸡胚分离结果  34
    3.1.2 病毒鸡胚半数致死量（ELD50）的测定  34-35
    3.1.3 动物回归实验  35
    3.1.4 常见鸭病毒病的检测  35
    3.1.5 病毒的血凝试验结果  35
    3.1.6 病毒的有机溶剂敏感性试验结果  35
    3.1.7 病毒的核酸类型鉴定  35
    3.1.8 病毒的电镜观察结果  35
    3.1.9 病毒基因组 S2 节段部分序列的扩增  35-36
    3.1.10 核酸同源性分析及系统进化分析  36-37
  3.2 病毒在 BHK-21 细胞系中的增殖特性研究  37-41
    3.2.1 病毒适应 BHK-21 细胞系  37
    3.2.2 病毒 TCID50 测定  37
    3.2.3 RT-PCR 检测  37-40
    3.2.4 Western blot 检测结果  40
    3.2.5 IFA 检测结果  40-41
    3.2.6 病毒在 BHK-21 细胞中的增殖规律  41
  3.3 DRVTH11 株病毒对动物致病性试验  41-44
    3.3.1 麻鸭致病性实验  41-42
    3.3.2 组织病理学观察及免疫组化结果  42-43
    3.3.3 SPF 鸡致病性实验  43-44
  3.4 鸭源呼肠孤病毒全基因组序列测定及分析  44-50
    3.4.1 DRV TH11 株病毒全基因序列的测定  44
    3.4.2 DRV TH11 株病毒基因组结构的分析  44-45
    3.4.3 DRV TH11 株病毒与 MDRV 及 ARV 同源性分析  45-47
    3.4.4 DRV TH11 株病毒系统进化分析  47-50
4 讨论  50-51
5 结论  51-52
参考文献  52-57
致谢  57-58
作者简介  58
在读期间发表的学术论文  58

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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