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海洋细菌Catenovulum sp. DP03右旋糖苷酶的研究

作　者: 蔡阮鸿
导　师: 王淑军；刘兆普
学　校: 南京农业大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 右旋糖苷酶 Catenovulum sp. 海洋细菌 纯化 变异链球菌 生物膜
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


右旋糖苷酶(Dextranase, EC3.2.1.11)是专一性水解α-1,6-糖苷键的一种葡聚糖水解酶,主要用于水解制糖工业中由右旋糖酐,降低糖汁粘度和用于口腔牙菌斑的治疗。本实验从连云港海域筛选鉴定了一株产右旋糖苷酶的海洋细菌,对其产生的右旋糖苷酶进行纯化和性质研究,并研究探讨了该酶对变异链球菌生物膜的作用。1.产右旋糖苷酶海洋细菌DP03的筛选鉴定及产酶条件的研究从连云港海域分离得180株海洋细菌,其中4株产右旋糖苷酶,经复筛选择酶活力较高的菌株DP03进一步研究。菌株DP03呈短杆状,扫描电镜下该菌大小约为0.3～0.5μ m×0.7-1.0μ m,菌株DP03在4℃不生长,37℃生长,最适生长温度为30℃,无氯化钠不生长,最适生长氯化钠浓度为2%,该菌株尿素酶、接触酶、氧化酶、甲基红反应呈阳性,赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、V-P、吲哚实验呈阴性,能水解淀粉和油脂,能液化明胶、能利用纤维二糖、葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖和蔗糖；综合形态学鉴定、生理生化特征和16S rRNA基因的比对,将其鉴定为Catenovulum sp. DP03; Catenovulum sp. DP03细胞中含有34.56%十六碳饱和脂肪酸和1.26%的ω9□-十八碳单不饱和脂肪酸,含量分别为最高和最低；Catenovulum sp.DP03的G+C mol%为39.53%；将Catenovulum sp. DP03与Catenovulum agarivorans进行核酸杂交,结果显示两者的同源性为17.24%-21.43%,该数据表明Catenovulum sp.DP03可能是Catenovulum属的一个新种；对Catenovulum sp. DP03产右旋糖苷酶的条件展开研究,结果表明其在28h、30℃、pH8.0、25%装液量和1%浓度右旋糖苷T20诱导物下为最佳产酶条件,最佳碳、氮源分别为马铃薯淀粉和蛋白胨。2.海洋细菌DP03右旋糖苷酶的纯化及性质研究Catenovulum sp. DP03发酵上清液经超滤、乙醇沉淀、硫酸铵盐析和离子交换层析纯化得到右旋糖苷酶(Cadex)。该酶的分子量为75kDa; Cadex的最适作用温度和pH值分别为40℃和8.0,30℃以下温度及pH5-11保持稳定；底物特异性研究发现Cadex特异性水解α-1,6-糖苷键,催化产物研究表明Cadex水解右旋糖酐T70的主要产物是异麦芽三糖、异麦芽四糖和异麦芽五糖,因此,Cadex是专一性水解葡聚糖中α-1,6-糖苷键的内切型右旋糖苷酶；Cadex与纯化的Penicillium右旋糖苷酶比较酶活力,在Cadex的最适催化条件时,Cadex的比活力大约是Penicillium右旋糖苷酶的五倍,而在Penicillium右旋糖苷酶的最适催化条件时,Cadex的比活力大约是Penicillium右旋糖苷酶的两倍；Mn2+、Sr2+、0.1%的苯甲酸钠和5%的乙醇对右旋糖苷酶有一定的的激活作用,而Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe3+和0.1%的氟化钠酶活性有不同程度地抑制作用；Cadex动力学研究表明K m为0.92mg/mL, v max为102.8μ molIMO/mL·min; MALDI-TOF MS分析结果表明Cadex与现有报道的右旋糖苷氨基酸序列同源性较低；圆二色谱分析结果表明Cadex是一个良好折叠的蛋白,二级结构中含有较多的α-螺旋和β-折叠。3.海洋细菌DP03右旋糖苷酶Cadex对变异链球菌产生的生物膜的作用结晶紫染色法测量Cadex抑制变异链球菌产生生物膜形成的有效作用浓度(MBIC)和清除成熟生物膜的有效作用浓度(MBRC),结果表明MBIC90和MBRC50所需的Cadex浓度分别为30U/ml和20U/ml。不同浓度的Cadex对变异链球菌的生长没有作用。MBIC90浓度下扫描电镜结果表明Cadex可有效阻止变异链球菌形成生物膜结构。Cadex对已形成的变异链球菌生物膜也有较好的水解效果,干重法测量酶处理前后的生物膜清除情况,结果表明已形成的生物膜在24h内经MBRC50Cadex处理3次(共30min)的清除率接近30%。

全文目录


摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
引言  13-14
第一章 文献综述  14-26
  1.1 右旋糖酐  14-15
    1.1.1 右旋糖酐  14
    1.1.2 右旋糖酐的形成及性质  14-15
  1.2 右旋糖苷酶的研究概况  15-20
    1.2.1 右旋糖苷酶的定义  15
    1.2.2 右旋糖苷酶的来源及性质  15-18
    1.2.3 右旋糖苷酶的应用  18-20
  1.3 海洋微生物酶  20-23
    1.3.1 海洋微生物适冷酶和碱性酶  20-22
    1.3.2 海洋微生物酶的应用  22-23
  1.4 口腔牙菌斑  23-24
    1.4.1 人体口腔牙菌斑生物膜  23
    1.4.2 口腔牙菌斑的祛除研究  23-24
  1.5 本课题的研究意义  24-26
第二章 产右旋糖苷酶海洋细菌的筛选鉴定  26-38
  摘要  26-27
  2.1 材料与方法  27-30
    2.1.1 培养基  27
    2.1.2 材料与试剂  27
    2.1.3 菌株的筛选  27
    2.1.4 菌株形态及生理生化性质的研究  27-28
    2.1.5 菌株的分子生物学鉴定  28
    2.1.6 菌细胞脂肪酸的测定  28-29
    2.1.7 菌株G+C mol%含量  29
    2.1.8 菌株DP03的核酸杂交实验  29-30
    2.1.9 右旋糖苷酶活力的测定  30
  2.2 结果与分析  30-35
    2.2.1 菌株的筛选  30-31
    2.2.2 菌株DP03的形态学特征  31-32
    2.2.3 菌株DP03的生理生化特征  32-33
    2.2.4 菌株DP03的16S rDNA序列及系统进化树  33-34
    2.2.5 菌株DP03的细胞脂肪酸含量  34
    2.2.6 菌株G+C mol%含量测定  34
    2.2.7 菌株DP03与Catenovulum agarivorans核酸分子杂交  34-35
  2.3 讨论  35-38
第三章 Catenovulum sp.DP03产右旋糖苷酶发酵条件的研究  38-46
  摘要  38
  3.1 材料与方法  38-40
    3.1.1 培养基  38
    3.1.2 材料与试剂  38-39
    3.1.3 右旋糖苷酶活力的测定  39
    3.1.4 发酵温度对产酶的影响  39
    3.1.5 培养基初始pH对产酶的影响  39
    3.1.6 发酵时间对产酶的影响  39
    3.1.7 装液量对产酶的影响  39
    3.1.8 不同右旋糖酐浓度对产酶的影响  39
    3.1.9 碳、氮源对产酶的影响  39-40
  3.2 结果与分析  40-43
    3.2.1 产酶发酵温度  40
    3.2.2 产酶初始pH  40-41
    3.2.3 产酶时间  41
    3.2.4 装液量  41-42
    3.2.5 最佳右旋糖酐及浓度  42-43
    3.2.6 碳、氮源对产酶的影响  43
  3.3 讨论  43-46
第四章 Catenovulum sp.DP03右旋糖苷酶的纯化及性质研究  46-62
  摘要  46-47
  4.1 材料与方法  47-50
    4.1.1 培养基及试剂  47
    4.1.2 粗酶液的制备  47
    4.1.3 右旋糖苷酶的纯化  47-48
    4.1.4 酶的分子量和等电点  48
    4.4.5 酶活力的测定  48
    4.4.6 酶的最适催化温度和pH  48-49
    4.4.7 酶的稳定性  49
    4.4.8 金属离子及化合物对酶的影响  49
    4.4.9 酶的底物特异性及催化产物  49
    4.4.10 酶的催化动力学特征  49
    4.4.11 MALDI-TOF MS质谱对酶的分析  49-50
    4.4.12 圆二色谱对酶的分析  50
  4.2 结果与分析  50-58
    4.2.1 酶的纯化  50-51
    4.2.2 酶的最适催化pH和pH稳定性  51-52
    4.2.3 酶的最适催化温度和热稳定性  52-53
    4.2.4 金属离子及化合物对酶活力的影响  53-54
    4.2.5 酶的底物特异性及催化产物  54-56
    4.2.6 Cadex与Penicillium右旋糖苷酶活力比较  56
    4.2.7 酶的催化动力学特征  56-57
    4.2.8 MALDI-TOF MS质谱对酶的分析  57-58
    4.2.9 圆二色谱对酶的分析  58
  4.3 讨论  58-62
第五章 Catenovulum sp.右旋糖苷酶对变异链球菌生物膜作用  62-72
  摘要  62-63
  5.1 材料与方法  63-64
    5.1.1 右旋糖苷酶  63
    5.1.2 菌株与试剂  63
    5.1.3 右旋糖苷酶Cadex对变形链球菌S.mutans生长的影响  63
    5.1.4 右旋糖苷酶Cadex对牙菌斑生物膜形成的作用  63-64
    5.1.5 右旋糖苷酶Cadex对己形成牙菌斑生物膜的作用  64
  5.2 结果与分析  64-68
    5.2.1 右旋糖苷酶Cadex对变形链球菌S.mutans生长的影响  64-65
    5.2.2 右旋糖苷酶Cadex对牙菌斑生物膜形成的作用  65-67
    5.2.3 Cadex对已形成牙菌斑生物膜形成的作用  67-68
  5.3 讨论  68-72
全文结论  72-74
全文创新点  74-76
存在的问题及展望  76-78
参考文献  78-86
攻读硕士学位期间发表的论文  86-88
致谢  88

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
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